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钙激活蛋白酶(calpain)可以提高宰后肉嫩度,但是宰后不同冷却方式下肉嫩度的差异的主要原因却不是calpain酶所引起的,为了探讨宰后不同冷却方式下肉嫩度差异的主要原因,阐明caspase酶系统和肉嫩化过程的相互关系,本研究利用已建立的调节ATP代谢速度的三段冷却成熟模型,将8头荷斯坦阉割公牛按照当地生产工序进行屠宰。背最长肌左边部分作为对照组,置于4°C下,存放168 h,背最长肌右边部分作为处理组,依次放在4°C下4 h,15°C下4 h,4°C下160 h。在宰后0、4、8、12、24、48、72和168 h分别在荷斯坦阉割公牛的背最长肌中左右部分进行取样后,液氮保存。检测pH值、ATP/ADP/AMP、肌节长度、剪切力、肌原纤维小片化指数(MFI);采用Western blotting方法测定caspase-3、9、以及底物PARP分解片段;利用荧光定量法检测caspase-3、9活性;选用iTRAQ方法构建荷斯坦阉割公牛宰后不同冷却方式对提高嫩度过程中的蛋白质组图谱,具体研究结果如下:(1)宰后8、12和24 h三段冷却组(处理组)pH值显著低于传统4°C冷却组(对照组)(P<0.05),宰后8 h对照组ATP水平显著低于处理组(P<0.05),4 h后对照组肌节长度均显著小于处理组(P<0.05),在宰后1、7、14和21 d处理组的剪切力值显著低于对照组(P<0.05),48 h后处理组肌原纤维小片化指数显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,相比传统冷却法,三段冷却法对荷斯坦阉割公牛背最长肌处理后可得到较高嫩度。(2)宰后初期,处理组和对照组中35 kDa的caspase-3酶原分解成了有活性的18 kDa的片段,37 kDa的caspase-9酶原分裂成有活性的23 kDa有活性的片段。Caspase酶底物PARP的检测中发现113 kDa的PARP酶原分裂成有活性的24 kDa,同时处理组中牛宰后48 h剪切力与宰后caspase-9在8 h和12 h活性的比值明显小于对照组组(P<0.05),处理组中牛宰后48 h剪切力与宰后caspase-3在8、12和24 h活性的比值明显小于对照组(P<0.05)。结果表明,caspase酶参与了宰后荷斯坦阉割公牛的嫩化过程,同时与传统冷却法相比,在三段冷却法中caspase-3和caspase-9活性对肉嫩度发挥作用更大。(3)用iTRAQ试剂标记的三段冷却与传统冷却处理的肌肉蛋白质结果表明,获得与牛蛋白库相匹配的肽段15125个,鉴定牛蛋白质1740个,不同处理间差异性蛋白质有57个,其中与肌原纤维骨架相关的蛋白有12个。本文首次建立了不同冷却方式下荷斯坦阉割公牛的总蛋白质谱,以及三段冷却方式和传统冷却方式下的差异表达蛋白质谱。利用网络数据库资源对鉴定的差异性蛋白进行分子功能、生物学过程以及代谢通路分析,结果显示,鉴定的差异蛋白在细胞信号转导途径和肌原纤维蛋白分解途径占有较高的比例。本实验中发现了另外一些差异性蛋白,这些差异性蛋白可能是由于不同冷却处理造成了,也有可能是本身自身降解发生了差异,这将成为潜在的研究方向。