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口蹄疫（Foot-and-mouth disease）是人畜共患的烈性传染病,病原为口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）,该病被世界动物卫生组织（OIE）确定为对动物和动物产品国际贸易有重大影响的A类疾病。预防和控制口蹄疫的关键是使用免疫效果好的疫苗和快速准确的诊断方法。传统的方法有病毒分离、乳鼠接种试验等。基因芯片是近几年出现的新技术,具有快速和灵敏度高的特点,可以应用于微生物的检测,该特点符合口蹄疫诊断的需要;另外,在临床实际中,区分口蹄疫病毒自然感染和疫苗免疫动物的快速鉴别诊断方法对于该病的控制具有重要的现实意义。为此,本研究开展了以下两个方面的工作。 1.检测口蹄疫病毒基因芯片技术的研究 本研究根据O型口蹄疫病毒拓扑型理论和Genbank上公布的口蹄疫病毒的核酸序列,借助DNAman 5.2.2和Primer Premier 5.0生物学软件设计了检测口蹄疫病毒的6条种属探针和12条拓扑型探针,每个探针5’端连接12 T后氨基修饰,然后通过点样、固定、封闭等步骤将探针固定在醛基化玻璃片上制备成检测芯片。分别提取5株口蹄疫病毒的RNA,经反转录和PCR掺入Cy3-dCTP荧光标记后,与芯片上的探针特异性杂交,然后对芯片进行扫描,根据荧光强度判断检测结果。结果显示,5株口蹄疫病毒均能被检出,与基因测序结果基本一致,表明本法可以用于口蹄疫病毒的检测。 2.口蹄疫3B-ELISA鉴别诊断方法的初步建立 从口蹄疫病毒细胞培养物中提取总RNA,经一步法RT-PCR获得了长度约230bp的3B基因片段,将PCR产物连接到pMD-18-T载体,获得重组质粒并测序,用BamH Ⅰ与HindⅢ双酶切此重组质粒后,回收3B基因并连接到pGEX-KG载体上形成表达质粒pGEX-KG-3B,转化BL21（DE3）,筛选阳性重组工程菌;重组蛋白在27℃下,用IPTG诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质斑点杂交,结果表明3B基因主要以可溶形式高效表达,表达产物具有免疫原性。以纯化的表达产物为抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）方法。方阵滴定确定最佳包被浓度是6.1μg/孔,最佳血清稀释倍数为1:80;通过测定36份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准。特异性、重复性试验结果表明,该方法特异性强、重复性好;用3B-ELISA方法与美国联合生物医学公司（UBI）生产的合成肽检测试剂盒UBI? FMDV NS-ELISA对比检测44份血清,符合率为87.1%。证明3B-ELISA方法可用于口蹄疫的鉴别诊断。 通过本研究所制备的基因芯片和检测技术以及3B-ELISA,可分别用于分离毒株的快速鉴定或动物感染与免疫的血清学鉴别诊断,为我国对该病的检测提供了可靠的技术手段,具有极大的应用前景。