论文部分内容阅读
目的膀胱癌（Bladder cancer,BLC）是泌尿系统常见恶性肿瘤,是全球第十大常见癌症,严重危害着人类健康,虽然目前治疗手段较多,膀胱癌患者的复发率及病死率仍居高不下。近几十年来,研究发现仅凭肿瘤分级和分期并不能准确预测膀胱癌的生物学行为来指导治疗及评估预后,特别是在高危病例中。因此,一种新的更为准确的评估膀胱癌预后的生物标记物的开发具有重要意义。微小RNA（Micro RNA,mi RNA）是长度在21-22个核苷酸之间的小RNA,很大一部分mi RNA是高度保守的,定位在基因组中,由物理上相邻的mi RNA转录在一起,并显示出相似的表达谱。目前,大量研究表明mi RNA是细胞中最重要的成分之一,并且在肿瘤的演变中起着重要作用,且在膀胱癌中也有相当多的研究,但是目前仍缺乏灵敏度及特异性较高的评估膀胱癌预后的mi RNA。在本研究中,通过下载癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov）数据库中有关膀胱癌的区分3p5p的mi RNA构建预后模型,并进行预后风险评估,以期找出膀胱癌的预后生物标记物,为膀胱癌的预后预测提供新思路。方法1.本研究所用到的膀胱癌相关的区分3p5p的mi RNA均通过TCGA官方网站下载完成,其中包含19个正常组织和418个膀胱癌组织样本,利用Perl（Practical Extraction and Report Language,版本v5.28.1,https://www.perl.org）程序进行合并成矩阵及ID转换,应用R（The R Programming Language,R版本4.0.3,https://cran.r-project.org）程序的程序包“Edger”包进行差异表达分析,将FDC＞1.5和FDR＜0.05设定为筛选条件,应用R程序筛选出在膀胱癌组织样本中差异表达的相关的区分3p5p的mi RNA进行分析并存储。2.使用R程序对所得mi RNA进行Cox回归分析（Cox’s proportional hazards regression model）、Lasso回归分析（Least absolute shrinkage and selection operator）。根据mi RNA表达量及回归系数（coef）计算出区分3p5p的mi RNA相关的膀胱癌样本的风险值（risk score）,根据其中位数分为高、低风险组。应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）及Kaplan-Meier生存曲线进行验证结果,并绘制直观可视的图形。3.应用R程序对所得mi RNA进行靶基因预测及富集分析,得出有意义基因及通路信号。结果1.通过TCGA数据库获得了418个膀胱癌组织样本和19个正常组织样本数据,并构建矩阵及ID转换,进行差异表达基因的分析,共筛选出311个mi RNA明显不同于正常组织,包括明显下调的50个mi RNA和明显上调的261个mi RNA。2.通过R程序应用Cox、Lasso等多种回归分析手段构建出膀胱癌预后风险模型。模型中有8个mi RNA的P＜0.05,提示有统计学意义,应用Kaplan-Meier生存曲线分析分别对8个mi RNA进行分析。其中hsa-mi R-194-5p,hsa-mi R-25-5p,hsa-mi R-615-3p,hsa-mi R-6728-5p（P＜0.05）可作为评估膀胱癌预后的mi RNA,另外4个无统计学意义。3.对4个有意义的mi RNA进行靶基因预测,因靶基因数据库众多,选取可信度比较高的两个数据库（分别为Target Scan和mi Walk）,并与TCGA数据库中膀胱癌组织差异表达的m RNA（将FDC＞1.5和FDR＜0.05设定为筛选条件）取交集获得735个靶基因,并对其进行富集分析,GO功能注释分析（Gene Ontology）显示靶基因参与离子跨膜转运的调控、膜电位的调节、跨膜转运复合体等功能;KEGG通路富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）显示靶基因参与配体受体相互作用通路、钙离子信使通路、c AMP信号通路、c GMP-PKG信号通路等信号通路。结论1.通过TCGA肿瘤数据库筛选出的23个区分3p5p的mi RNA构建预后风险模型,对评估膀胱癌的预后具有良好的灵敏度及特异性。并得出4个mi RNA（分别为hsa-mi R-194-5p,hsa-mi R-25-5p,hsa-mi R-615-3p,hsa-mi R-6728-5p）作为膀胱癌预后的候选生物标记物,为膀胱癌的预后预测提供了新思路。2.通过GO功能注释、KEGG富集分析可得出,这4个mi RNA可通过c AMP、c GMP-PKG信号通路作用于膀胱癌,但其是否参与膀胱癌的增殖、侵袭及转移,仍需进一步实验进行验证。