【摘 要】
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目的:利用TCGA数据库进行ApoM与肝细胞癌的相关性分析并从在体及离体水平观察ApoM基因的表达水平对肝细胞癌增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,进而探讨ApoM在肝细胞癌发生与发展过程中的作用。方法:利用TCGA数据库分析ApoM基因在癌与癌旁组织中表达水平的差异,并从在体水平和细胞水平进行验证;为了探究ApoM表达水平的高低对肝癌细胞的影响,利用Crispr-Cas9技术在小鼠肝癌细胞系Hepa1
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目的:利用TCGA数据库进行ApoM与肝细胞癌的相关性分析并从在体及离体水平观察ApoM基因的表达水平对肝细胞癌增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,进而探讨ApoM在肝细胞癌发生与发展过程中的作用。方法:利用TCGA数据库分析ApoM基因在癌与癌旁组织中表达水平的差异,并从在体水平和细胞水平进行验证;为了探究ApoM表达水平的高低对肝癌细胞的影响,利用Crispr-Cas9技术在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6及人肝癌细胞系Huh-7上建立ApoM基因缺失及过表达的细胞模型并通过Edu细胞增殖实验、裸鼠植瘤实验及细胞周期实验来探究ApoM基因对肝癌细胞增殖活力及细胞周期的影响;为了探究ApoM基因缺失影响肝癌细胞周期的具体环节,首先利用TCGA数据库在肝细胞癌的临床样本中进行ApoM基因及相关细胞周期因子的相关性分析并通过Western-blot方法进行验证;利用细胞流式术分析ApoM基因表达水平对肝癌细胞凋亡的影响并通过Western-blot方法进行验证;利用Transwell及Western-blot实验分析ApoM基因对肝癌细胞侵袭及迁移能力的影响;为了探究ApoM在原发性肝癌发生过程中的作用,利用C57BL/6J小鼠并注射N-亚硝基二乙胺诱导原发性肝癌,观察ApoM基因敲除对原发性肝癌产生速率的影响;利用血生化分析及油红O染色探讨ApoM基因敲除对肝癌细胞脂质代谢的影响;利用生物信息学及Western-blot实验分析ApoM基因敲除对脂代谢及相关关键蛋白FASN及SREBP1的影响。结果:1.TCGA数据库分析肝细胞癌50例配对样本及肝癌患者的癌组织与癌旁组织中ApoM的表达水平（P=0.025）,免疫组化方法检测肝癌患者中癌组织及癌旁组织ApoM基因的表达水平（P=0.00025）,结果提示癌组织中ApoM的表达水平低于癌旁组织;WB方法检测正常小鼠肝细胞系AML12中ApoM的表达水平高于肝癌细胞系Hepa1-6（P=0.012）。2.ApoM基因抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力并上调其凋亡水平。2.1EDU、裸鼠实验提示,ApoM基因缺失组的Hepa1-6及Huh-7肝癌细胞的增殖活力显著增高（P=0.00050,P=0.017）,ApoM基因过表达组则下降（P=0.070,P=0.032）;细胞周期实验提示ApoM基因敲除加快肝癌细胞G1期转向S期,而ApoM基因过表达则导致肝癌细胞阻滞在G1期,抑制细胞转向S期。WB实验提示ApoM基因敲除影响肝癌细胞G1/S期转化相关关键调节蛋白的表达水平增高,并且阻碍Cyclin E1与CDK2复合体的形成。2.2流式细胞术及WB实验提示ApoM基因缺失组肝癌细胞中促凋亡相关关键蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Bax/Bcl-2显著升高;过表达组则相反（P<0.05）。2.3ApoM基因缺失组肝癌细胞侵袭迁移能力显著增加,且MMP-2蛋白的表达水平显著升高,过表达组则反之（P<0.05）。3.在N-亚硝基二乙胺诱导小鼠原发性肝癌的实验中,ApoM基因敲除小鼠相较于野生型小鼠具有更快的成瘤速度和更低的存活率（P<0.05）;同时ApoM基因敲除组小鼠的肝癌组织的凋亡水平较WT组显著下降（P<0.05）。4.在二乙基亚硝胺诱导情况下,相较于正常野生型小鼠,ApoM基因敲除组小鼠肝功能受损且甘油三酯水平显著增高（P<0.05）;且蛋白网络及富集分析结果显示,ApoM与肝脂代谢相关蛋白LPA、APOM、GPANK1、APOA2、APOC2、PON1等存在相互作用关系,并且可能参与胆固醇外流、细胞外结构组织形成、高密度脂蛋白颗粒组装、低密度脂蛋白颗粒重塑等过程;WB检测提示相较于对照组,ApoM基因敲除组肝癌细胞中FSAN、SREBP1表达水平显著增加（P<0.05）。结论:1.肝癌患者中癌组织的ApoM表达水平低于癌旁组织。2.ApoM基因抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力并上调其凋亡水平。3.ApoM基因的缺失促进二乙基亚硝胺诱导小鼠的肝癌速率,并促进肝功能紊乱。4.ApoM基因的缺失上调SREBP1和FASN的表达,引起脂代谢紊乱,进而影响肝癌的发生发展。
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