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肺癌是恶性程度较高的肿瘤疾病,其中小细胞肺癌具有极高侵袭性且生长迅速。Sirtuin 3(SIRT3)是一种NAD依赖的去乙酰化酶,主要存在于线粒体中。SIRT3对肿瘤具有重要作用,可根据细胞类型、肿瘤类型而发挥抑癌基因或致癌基因的作用。据文献报道p53可能是SIRT3的一个靶点。p53在小细胞肺癌中常常发生突变,肺癌中由于大多数化疗药物都能诱导DNA损伤,并能激活p53蛋白,而p53基因的突变会对这种治疗产生负面影响,突变型p53稳定性较野生型强,且可以发挥癌基因的功能,因此寻找针对突变型p53的调控分子进而抑制突变型p53的癌基因功能就成为我们需要解决的问题。本实验室前期工作发现在肺癌患者中突变型p53与SIRT3表达呈现负相关,并且SIRT3可能引起突变型p53的表达下降,所以我们推测SIRT3可能影响了突变型p53的翻译后修饰和稳定性,最终导致突变型p53的降解。1.目的:探讨SIRT3对小细胞肺癌NCI-H446的作用及机制:(1)SIRT3对肺癌的抑制作用;(2)SIRT3对突变型p53稳定性的影响;(3)SIRT3对突变型p53稳定性影响的机制。2.方法:培养NCI-H446细胞,分为CON组、NC组(转染空载质粒)和SIRT3组。光学显微镜下观察细胞形态;MTT检测细胞生存率;AnnexinV-FITC流式细胞术检测凋亡情况和JC-1检测线粒体膜电势;Western Blot检测cleaved-Caspase9,Bcl-2,Bax,MCL-1,Bid,cleaved-Caspase3等凋亡相关蛋白的表达;RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2,Bax,Caspase-3,p53的基因水平表达;MTT检测加入坏死性凋亡抑制剂Nec-1后细胞生存率;Western Blot检测坏死性凋亡相关蛋白caspase8,RIP1,MLKL的表达水平。培养NCI-H446细胞,分为CON组、NC组(转染空载质粒)和SIRT3组,Western Blot实验检测转染SIRT3后突变型p53蛋白表达情况;转染SIRT3后加入CHX检测突变型p53的半衰期的变化。免疫共沉淀实验检验突变型p53和泛素蛋白的结合能力。为了证明SIRT3过表达后突变型p53发生泛素化降解,转染SIRT3后加入泛素化抑制剂MG132进行实验,将细胞分为5组:CON组、NC组、SIRT3组、MG132组、SIRT3+MG132组,Western Blot检测突变型p53的表达。构建裸鼠肺癌皮下移植瘤模型,将裸鼠分为PQ组、SIRT3组。使用本实验室一直保存的具有肿瘤靶向性减毒沙门氏菌。将SIRT3转入其中,治疗方法采用腹腔注射,观察肿瘤生长变化,苏木精伊红染色染色观察组织形态变化,免疫组织化学法检测SIRT3、突变型p53的表达;利用Western Blot和RT-PCR实验检测SIRT3、突变型p53、及凋亡相关蛋白和基因水平的表达。3.结果转染SIRT3的NCI-H446细胞中,光镜观察发现细胞发生大量死亡,MTT结果显示SIRT3抑制细胞生长(P<0.05);Annexin V-FITC流式细胞术显示,相对于NC组,转染SIRT3能促进细胞发生凋亡(P<0.05);JC-1染色发现相比于NC组,SIRT3能降低细胞内线粒体膜电势(P<0.05);Western Blot结果显示SIRT3能上调Caspase 9、Bax、Bid、Cleaved-Caspase3等促凋亡蛋白,下调Bcl-2、MCL-1凋亡抑制蛋白(P<0.05);RT-PCR结果显示p53、Bax、Caspase 3的上调,Bcl-2的下调(P<0.05),从基因水平上证明了SIRT3使细胞发生凋亡;MTT检测加入坏死抑制剂Nec-1后细胞生存率结果说明SIRT3能使细胞发生部分坏死(P<0.05);Western Blot检测坏死性凋亡相关蛋白RIP1、MLKL表达均上调(P<0.05);Western Blot检测过表达SIRT3后与CON组比较,突变型p53表达降低,p53表达上调(P<0.05)。为了探究突变型p53降解的原因,Western Blot检测加入蛋白酶体抑制剂MG132后突变型p53的蛋白水平的表达,发现突变型p53都发生了蛋白酶体降解。CHX检测MDM2和突变型p53的半衰期,结果显示与CON组相比,突变型p53半衰期明显变短,说明SIRT3有破坏其稳定性的作用。免疫共沉淀实验结果显示突变型p53与泛素结合能力增强,证明了SIRT3可以调控突变p53的泛素化降解。体内实验中,SIRT3能抑制小鼠肺癌移植瘤的生长,Western Blot和RT-PCR分别从蛋白和基因水平证明了SIRT3能使肿瘤中突变型p53表达降低,从而抑制肿瘤的发展。4.结论(1)SIRT3可以抑制肺癌细胞NCI-H446的生长,诱导其发生凋亡及坏死性凋亡;(2)SIRT3过表达能改变突变型p53的稳定性;(3)SIRT3过表达可通过泛素化蛋白降解途径使突变型p53降解。