子宫内膜损伤引起的宫腔粘连是育龄期妇女不孕的重要原因之一,目前治疗的方法有限。脂肪间充质干细胞在这一领域获得了较好的疗效。随着研究的深入,越来越多的证据表明,间充质干细胞的治疗效果主要取决于其旁分泌功能,并由间充质干细胞衍生的外泌体所介导。相比于传统的细胞治疗,外泌体的生物活性更稳定,易保存,提取过程更易标准化,且不用担心致瘤性的风险,因此有望成为无细胞治疗的新策略。本研究旨探索来源于脂肪间充质干细胞的外泌体对宫腔粘连模型大鼠的治疗潜力。第一部分脂肪间充质干细胞外泌体的分离与鉴定目的:从大鼠脂肪组织中分离、培养出脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ASCs),从其培养基上清液中提取出外泌体(Exosomes),用于后续实验。方法:1. 在无菌条件下,收集SD大鼠腹股沟脂肪,用酶消化法分离提取ASCs传代、纯化、培养。通过流式细胞技术鉴定ASCs表面标记分子,如CD90、CD105、CD45、CD34,进行成脂、成骨诱导分化培养,采用油红O及茜素红染色鉴定诱导分化情况。2.采用超速离心法从ASCs培养基上清液中提取外泌体,使用BCA试剂盒检测外泌体的浓度。并利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术及免疫印迹法对提取出的外泌体进行鉴定。结果:1.ASCs贴壁生长,形态为长梭形,呈纤维细胞样漩涡状生长。第3代ASCs传代后,第1-2天生长较慢,是细胞生长的潜伏期,第3-5天,生长加速,为细胞的对数生长期,细胞培养第6天至顶峰继而平缓进入平台期。流式细胞学检测结果:CD90(+)、CD105(+)、CD34(-)及CD45(-),其表达率依次为98.39%、97.99%、0.91%、0.38%。定向诱导分化结果:成脂诱导培养后可见细胞形态变化,油红O染色呈橘红色;成骨诱导培养后可见矿化结节沉积,茜素红染色呈红色。2.透射电镜下外泌体呈圆形或茶托型或一侧凹陷的半球形的双层膜样结构,直径约30-200nm。蛋白浓度约为1.5mg/m L。采用Nanosight纳米颗粒分析仪检测发现ASCs-exo的平均直径为109.5nm,呈不规则布朗运动。Western Blot鉴定外泌体特异性标记蛋白CD63及Alix呈阳性表达。结论:1. 采用酶消化法可成功分离培养大鼠腹股沟处ASCs,并能通过流式细胞学与多向诱导分化进行鉴定。2.采用超速离心法可成功提取ASCs-exo。通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术及免疫印迹法鉴定,提取物与外泌体特征相符,可用于下一步实验。第二部分宫腔粘连模型稳定性探索目的:通过机械与感染双重损伤法、无水乙醇化学损伤法构建SD大鼠宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)动物模型,比较两种方法的造模效果,探索模型的长期稳定性。方法:1.80只SD雌鼠随机分为正常对照组、双重损伤组和乙醇损伤组。对照组20只,余两组分别30只。采用阴道盐水涂片法来确定雌鼠的动情周期。对照组仅开关腹,不进行其他操作;双重损伤组刮宫后宫腔留置脂多糖棉线,48h后撤出;乙醇损伤组宫腔注射95%无水乙醇4min损伤子宫内膜。2.分别于术后1、2、4、8、12周,每组随机抽取3只动物收集子宫组织,行HE和Masson切片染色,对子宫内膜厚度、腺体数量和纤维化面积进行统计学分析,行免疫组织化学染色观察CD31在子宫内膜上的表达情况。结果:1.双重损伤组和乙醇损伤组子宫内膜厚度在造模2周后均明显小于正常对照组(P<0.05),且趋于稳定。乙醇损伤组子宫内膜厚度较双重损伤组减少更为明显(P<0.05);2.双重损伤组和乙醇损伤组子宫内膜腺体数量在造模1周后均明显少于正常对照组(P<0.05),乙醇损伤组子宫内膜腺体较双重损伤组减少更为明显(P<0.05);3.双重损伤组和乙醇损伤组子宫内膜纤维化面积在造模1周后均高于正常对照组(P<0.05),但乙醇损伤组纤维化面积在造模8周以后明显减少(P<0.05);4.双重损伤组和乙醇损伤组子宫内膜间质CD31表达量在造模1周后均明显少于正常对照组(P<0.05),乙醇损伤组较双重损伤组减少更为明显(P<0.05)。结论:1. 双重损伤法和乙醇损伤法均能诱导宫腔粘连2. 双重损伤法造模更贴近临床的损伤模式,模型的纤维化程度更稳定,可以满足宫腔粘连相关研究需求。3. 乙醇损伤法操作简单、经济,但纤维化稳定性欠佳,其子宫内膜厚度、腺体数量及血管改变符合薄型子宫内膜的病理变化,可能更适用于薄型子宫内膜疾病的相关研究。第三部分脂肪间充质干细胞来源的外泌体治疗大鼠宫腔粘连的疗效评价目的:研究脂肪间充质干细胞来源的外泌体治疗宫腔粘连模型大鼠的有效性。方法:1.选择纤维化程度更加稳定的双重损伤法构建宫腔粘连模型,建模2周后给予不同的方案进行治疗。2.将48只大鼠随机分为4组,每组12只:1)对照组,造模和治疗时仅给予开关腹手术,不做任何治疗;2)模型组,造模2周后每侧宫角给予0.2m L PBS沿子宫纵轴行肌壁间注射;3)ASCs组,造模2周后每侧宫角给予细胞悬液0.2m L(含ASCs 1×10~6个)沿子宫纵轴行肌壁间注射;4)ASCs-exo组,造模2周后每侧宫角给予100μg/0.2m L ASCs-exo沿子宫纵轴行肌壁间注射。治疗4周后处死24只大鼠(每组6只),收集子宫组织用于下一步研究。3. 收集子宫组织,采用HE染色观察子宫内膜的形态学变化,记录子宫内膜厚度和腺体数量。通过Masson染色观察子宫内膜纤维化情况,利用IPP6.0软件量化分析各形态学指标的变化。采用免疫组化染色观察子宫内膜血管(CD31)和上皮(CK7)的恢复情况。4. 提取子宫组织蛋白,采用Western Blot检测子宫内膜容受性相关蛋白整合素、LIF和VEGF的表达水平。5. 生育力评价:治疗4周后,四组分别取6只大鼠,按照1:1的比例与生育力正常的雄性大鼠进行合笼。记录大鼠的受孕时间、妊娠率及胚胎数目。结果:1.病理形态学相关指标的变化1)子宫内膜厚度:模型组子宫内膜厚度明显小于正常对照组(526.90±79.68μm vs 738.29±18.16μm,P=0.009)。治疗4周后,ASCs组和ASCs-exo组子宫内膜厚度均明显大于模型组(797.38±45.26μm vs 526.90±79.68μm,P=0.001;782.45±43.40μm vs 526.90±79.68μm,P=0.002);ASCs组和ASCs-exo组子宫内膜厚度无明显差异(797.38±45.26μm vs782.45±43.40μm,P=0.840)。2)子宫内膜腺体数量:模型组子宫内膜腺体数量明显少于正常对照组(4.96±1.25 vs 8.17±0.47,P=0.103),但差异无统计学意义。治疗4周后,ASCs组和ASCs-exo组子宫内膜腺体数量均明显多于模型组(13.13±1.55 vs 4.96±1.25,P=0.000;12.04±1.69 vs 4.96±1.25,P=0.001);ASCs组和ASCs-exo组子宫内膜腺体数量无明显差异(13.13±1.55 vs12.04±1.69,P=0.570)。3)子宫内膜纤维化面积比率:模型组子宫内膜纤维化面积比率明显大于正常对照组(50.23%±1.99%vs 34.65%±3.55%,P=0.000)。治疗4周后,ASCs-exo组子宫内膜纤维化面积比率明显小于模型组(36.90%±1.03%vs 50.23%±1.99%,P=0.001);ASCs组子宫内膜纤维化面积比率也小于模型组(48.56%±2.41%vs 50.23%±1.99%,P=0.630),但差异无统计学意义;ASCs-exo组子宫内膜纤维化面积比率明显小于ASCs组(36.90%±1.03%vs 48.56%±2.41%,P=0.003)。2.免疫组化结果1)CD31表达:CD31是新生血管的标志,在模型组表达减少。治疗4周后,ASCs组和ASCs-exo组均高于模型组,且ASCs-exo组稍多于ASCs组。2)CK7表达:CK7是新生上皮的标志,模型组CK7仅有少量表达,治疗4周后,ASCs组和ASCs-exo组均明显高于模型组,且ASCs-exo组稍多于ASCs组。3.Western Blot结果1)Integrinβ3表达:模型组子宫内膜Integrinβ3表达量明显低于正常对照组(P=0.000)。治疗4周后,ASCs组和ASCs-exo组子宫内膜Integrinβ3表达量均明显高于模型组(P=0.000;P=0.009);且ASCs组高于ASCs-exo组(P=0.015)。2)LIF表达:模型组子宫内膜LIF表达量明显低于正常对照组(P=0.021)。治疗4周后,ASCs组和ASCs-exo组子宫内膜LIF表达量均明显高于模型组(P=0.014;P=0.026);ASCs组和ASCs-exo组无明显差异(P=0.783)。3)VEGF表达:模型组子宫内膜VEGF表达量明显低于正常对照组(P=0.005)。治疗4周后,ASCs-exo组明显高于模型组(P=0.004),也明显高于ASCs组(P=0.018)。4.生育力评价1)妊娠率:合笼4周后,模型组妊娠率明显低于正常对照组(16.67%vs 100.00%,P<0.05);ASCs组和ASCs-exo组均高于模型组(50.00%vs16.67%,P>0.05;83.33%vs 16.67%,P>0.05),且ASCs-exo组高于ASCs组,但差异无统计学意义。合笼8周后,模型组妊娠率仍低于正常对照组(50.00%vs 100.00%,P>0.05),ASCs组和ASCs-exo组均高于模型组(66.67%vs 50.00%,P>0.05;83.33%vs 50.00%,P>0.05),且ASCs-exo组高于ASCs组,但差异均无统计学意义。2)胎鼠数目:合笼8周后,模型组胎鼠数目明显少于正常对照组(1.00±0.52 vs 9.83±0.79,P<0.05);ASCs组和ASCs-exo组均明显多于模型组(6.67±2.22 vs 1.00±0.52,P<0.05;5.00±1.10 vs 1.00±0.52,P<0.05),差异有统计学意义;ASCs组稍多于ASCs-exo组(6.67±2.22 vs 5.00±1.10,P>0.05),但差异无统计学意义。3)受孕时间:合笼8周后,模型组大鼠受孕所需时间明显长于正常对照组(42.00±8.79 vs 2.00±0.52,P<0.05)。ASCs组和ASCs-exo组受孕时间均较模型组缩短(31.50±9.43 vs 42.00±8.79,P>0.05;13.83±8.95vs 42.00±8.79,P>0.05),且ASCs-exo组更短于ASCs组(13.83±8.95 vs31.50±9.43,P>0.05),但差异无统计学意义。结论:ASCs及其来源的外泌体均能明显改善和修复模型大鼠受损的子宫内膜形态,减少间质纤维化面积,增加子宫内膜容受性并提高生育力。在容受性相关蛋白如VEGF表达、改善纤维化程度、合笼后妊娠率及受孕时间等方面ASCs来源的外泌体似乎较ASCs更有优势。