【摘 要】
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含溴结构域蛋白2（bromodomain-containing protein 2,BRD2）具有两个串联的溴结构域和一个末端外结构域,是溴结构域和末端外结构域蛋白家族成员之一。BRD2蛋白能够特异性结合组蛋白乙酰化赖氨酸,参与基因的转录调控、染色质重塑和细胞增殖与凋亡等生物学活动。目前,国内外关于BRD2基因的研究主要集中在人和小鼠上,而对鸡BRD2基因的研究报道相对较少,特别是关于鸡BRD2基
【基金项目】
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国家自然科学基金（地区科学基金）项目《新城疫病毒M蛋白与转录调节因子BRD2互作调控病毒复制的作用机制》（31960698）,2020.1-2023.12； 贵州省科学技术基金项目《转录调节因子BRD2与M蛋白互作促进新城疫病毒复制的作用机制研究》（黔科合基础[2020]1Y134）,2020.3-2023.3；
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含溴结构域蛋白2（bromodomain-containing protein 2,BRD2）具有两个串联的溴结构域和一个末端外结构域,是溴结构域和末端外结构域蛋白家族成员之一。BRD2蛋白能够特异性结合组蛋白乙酰化赖氨酸,参与基因的转录调控、染色质重塑和细胞增殖与凋亡等生物学活动。目前,国内外关于BRD2基因的研究主要集中在人和小鼠上,而对鸡BRD2基因的研究报道相对较少,特别是关于鸡BRD2基因及其剪接体的组织表达特征、亚细胞定位及其相互作用的细胞蛋白尚不清楚。因此,本研究首先对鸡BRD2基因及其剪接体进行克隆和生物信息学分析和组织表达特征分析;构建鸡BRD2基因及其剪接体的重组真核表达载体,转染细胞后观察其在细胞中的亚细胞定位;进一步通过免疫共沉淀结合质谱鉴定方法筛选鸡胚成纤维细胞（DF-1）中与鸡BRD2及其剪接体蛋白互作的细胞蛋白并进行生物信息学分析,然后选取其中一个细胞蛋白进行相互作用验证。主要研究结果如下:1.成功扩增鸡BRD2基因及其剪接体的ORF,并进行克隆和测序。序列分析结果表明,鸡BRD2基因及其剪接体ORF全长分别为2340 bp（BRD2）、2283bp（BRD2-X1）、2301 bp（BRD2-X2）和1983 bp（BRD2-X3）,编码779、767、761和661个氨基酸;鸡BRD2及其剪接体蛋白二级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成。荧光定量PCR检测结果显示,在鸡发育的不同阶段,BRD2基因及其剪接体在各组织之间均有表达,且同一日龄不同组织之间mRNA表达量存在差异,其中BRD2和BRD2-X2呈上调表达且在肺脏中表达量最高,而BRD2-X1和BRD2-X3呈下调表达且在肺脏中表达量最低。2.成功构建鸡BRD2基因及其剪接体的重组真核表达载体pEGFP-BRD2、pEGFP-BRD2-X1、pEGFP-BRD2-X2、pEGFP-BRD2-X3,将其转染细胞后通过Western blotting证实融合蛋白在细胞内得到正确的表达。亚细胞定位观察结果显示,鸡BRD2基因融合蛋白GFP-BRD2及其剪接体融合蛋白GFP-BRD2-X1、GFP-BRD2-X2和GFP-BRD2-X3均定位在细胞核,但是GFP-BRD2和GFP-BRD2-X1在细胞核中呈均匀分布,而GFP-BRD2-X2和GFP-BRD2-X3在细胞核中呈不均匀的点状分布。3.分别筛选到225、185、137和34种细胞蛋白与鸡BRD2、BRD2-X1、BRD2-X2和BRD2-X3蛋白存在相互作用。GO功能注释表明,与BRD2互作的蛋白主要参与基因的转录调节、细胞周期和发育和代谢与生物调节过程;与BRD2-X1互作的蛋白主要参与基因的转录调节、转录与翻译、代谢与生物调节和免疫与病毒感染过程;与BRD2-X2互作的蛋白主要参与基因的转录调节、代谢与生物调节和免疫与病毒感染过程;与BRD2-X3互作的蛋白主要参与免疫与病毒感染过程。与BRD2及其剪接体蛋白互作的蛋白都具有核酸结合、蛋白质结合和酶活性调节的分子功能,且主要定位于细胞核内,部分定位于细胞质。KEGG信号通路显示,与鸡BRD2及其剪接体互作蛋白都主要涉及遗传信息过程、翻译过程、其次是免疫系统和细胞发育过程。4.将构建的鸡BRD2基因与MATR3基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2和p CMV-Myc-MATR3分别共转染DF-1细胞,通过荧光共定位观察鸡BRD2蛋白与MATR3蛋白在细胞内的共定位情况,并利用免疫共沉淀的方法验证鸡BRD2蛋白与MATR3蛋白的相互作用。结果表明,鸡BRD2蛋白与MATR3蛋白的融合蛋白GFP-BRD2和Myc-MATR3均分布在细胞核,且在细胞核内具有明显的共定位;免疫共沉淀试验结果表明,鸡BRD2蛋白与MATR3蛋白存在相互作用。以上结果表明,鸡BRD2蛋白与MATR3蛋白在细胞核内具有相互作用。
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