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猪流行性日本乙型脑炎简称猪乙脑是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种人兽共患疾病,广泛存在于亚洲到澳大利亚的北半球区域,主要通过蚊虫叮咬传播,对养猪业和人类健康有极大危害,本研究研制出的日本乙型脑炎病毒双抗体夹心ELISA试剂盒可用于猪乙脑疫病的检测。1.猪日本乙型脑炎双抗体夹心ELISA方法的建立本研究使用NJ1-1株JEV病毒,在BHK21细胞中培养,纯化后作为抗原,灭活病毒后与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂佐剂混合使用,通过注射兔不同部位获得兔抗JEV高免血清,通过辛酸-硫酸法初提以及Protein A亲和层析的方法得到了纯化效果好的兔抗JEV的IgG作为捕获抗体。使用本实验室制备并保存的JEV-1单克隆抗体杂交瘤细胞,通过注射处理过的BALB/C小鼠腹腔得到含单克隆抗体的小鼠腹水,并用经初提和Protein A亲和层析方法纯化后的单克隆抗体作为建立双抗体夹心ELISA方法的单抗来源。通过对各个反应条件的优化,确定了最佳工作条件：兔抗JEV抗体1：320倍稀释；单克隆抗体1：200倍稀释；羊抗鼠酶标抗体1：4000倍稀释,作用时间为1h；包被反应使用5%脱脂牛奶封闭1h；底物显色时间10min。用建立的双抗体夹心ELISA方法对其他常见疾病病原如伪狂犬病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒进行检测,并没具有明显交叉反应。通过对阴性样品的检测OD450值小于0.3时判断为阴性,OD450值大于0.5时判断为阳性,当OD450值介于0.3-0.5之间时判定义为疑似感染。敏感性试验表明当病毒含量达到1.004μg/ml以上时显示出阳性结果。2.猪乙型双抗夹心ELISA试剂盒的稳定性及初步应用使用同一批次的不同酶标板和不同批次试剂盒对同一样品进行检测和通过使用包装好的试剂盒对阳性样品每个月定期检测一次,以来检测该试剂盒稳定性。检测结果证明试剂盒重复性变异稀释小于10%,达到试剂盒要求,试剂盒可在4℃环境保存5个月。使用该试剂盒检测临床阳性样品中,符合率达到60%,该试剂盒适合于临床运用,为我国养殖业JEV防治提供了切实可行的技术手段,为猪日本乙型脑炎诊断试剂盒的商业化运用打下了基础。