论文部分内容阅读
研究背景本课题组前期研究发现,饮用水中亚硝胺和藻毒素高暴露可能是淮安地区食管癌高发的重要原因,亚硝胺和藻毒素可以发挥协同作用,诱导食管癌发生。随着表观遗传学的迅速发展,环状RNA（circRNA）引起了人们的广泛关注,作为潜在的分子生物标志物,circRNA在肿瘤的发生、发展中发挥了重要的调控作用。目前尚无circRNA在亚硝胺、藻毒素致食管癌中作用及机制的研究。识别circRNA在亚硝胺、藻毒素致食管细胞癌变过程中的作用及机制,将为我们理解食管癌发病机制提供新的思路,并提供潜在的诊断及治疗分子标志物。第一章食管癌相关circRNA筛选及分析1研究目的识别食管癌中差异表达circRNA及差异表达circRNA参与调控的功能及信号通路。2研究方法2.1食管癌差异表达circRNA的识别招募100例淮安地区经病理检查确诊的原发性食管癌患者,选取3例患者的食管癌和癌旁组织,使用去线性化RNA测序识别食管癌组织中差异表达circRNA。2.2食管癌差异表达circRNA参与调控功能及信号通路分析利用GO富集和KEGG pathway分析差异表达circRNA参与调控的功能及信号通路。2.3食管癌人群差异表达circRNA筛选选取去线性化RNA测序结果中差异倍数＞2,P＜0.05的45个circRNA,分别设计Covergent、Divergent引物,利用琼脂糖凝胶电泳结合Sanger测序对候选circRNA进行成环验证。使用RT-QPCR检测经成环验证的circRNA在100对食管癌和癌旁组织中表达。3研究结果3.1测序差异表达circRNA食管癌组织中共检出571个差异表达circRNA,其中335个下调表达,236个上调表达;circRNA12733下调表达最明显,下调倍数为77.04,Hsacirc0063865上调表达最明显,上调倍数为43.63。3.2差异表达circRNA参与调控功能及信号通路GO分析显示,差异表达circRNA主要参与了外来物质代谢、环氧化酶P450途径生物学过程。KEGG分析显示,差异表达circRNA参与调控了中枢碳代谢、化学致癌相关通路。3.3食管癌人群差异表达circRNA Hsacirc0011821、Hsacirc0012152、Hsacirc0008590、Hsacirc0005243、Hsacirc0064388、Hsacirc0003429、circRNA06349、circRNA19252、Hsacirc0063865、circRNA19586、Hsacirc0079227在食管癌人群组织中显著上调表达（P＜0.05）,H sacirc0002490、Hsacirc0009043、Hsacirc0000915、Hsacirc0008832、Hsacirc0071106、Hsacirc0005941、Hsacirc0065214、Hsacirc0006867、circRNA19586、c ircRNA32026、Hsacirc0060927、Hsacirc0008865、Hsacirc0000745、Hsacirc0002874在食管癌人群组织中显著下调表达（P＜0.05）。4研究结论食管癌差异表达circRNA可能参与调控了食管癌的化学致癌。第二章参与亚硝胺联合藻毒素致食管上皮细胞恶性转化circRNA筛选及分析1研究目的筛选参与亚硝胺联合藻毒素致食管上皮细胞恶性转化的circRNA,评估候选circRNA在恶性转化中的作用。2研究方法2.1食管上皮细胞恶性转化相关circRNA筛选使用亚硝胺联合藻毒素染毒诱导正常食管上皮细胞（Het-1A）恶性转化,利用RTQPCR检测筛选恶性转化细胞（Het-1A-T）细胞中异常表达circRNA。2.2细胞中候选circRNA参与恶性转化验证利用慢病毒转染构建候选circRNA（Hsacirc0006867、Hsacirc0063865、Hsacirc0071106）稳转高、低表达Het-1A细胞,使用亚硝胺联合藻毒素染毒诱导稳转细胞恶性转化,利用平板克隆、软琼脂克隆检测细胞成瘤能力。2.3裸鼠中候选circRNA参与细胞恶性转化验证利用裸鼠皮下成瘤、尾静脉转移瘤（小动物活体成像）实验评估稳转染毒细胞成瘤能力。3研究结果3.1恶性转化相关circRNA筛选恶性转化细胞中Hsacirc0006867显著下调表达,Hsacirc0063865、Hsacirc0071106显著上调表达。其中Hsacirc0063865、Hsacirc0071106随染毒代数增加呈上升趋势,Hsacirc0006867随染毒代数增加呈下降趋势。3.2细胞中候选circRNA参与恶性转化验证Hsacirc0006867过表达抑制、低表达促进细胞恶性转化,Hsacirc0063865过表达促进、低表达抑制细胞恶性转化,Hsacirc0071106低表达对细胞恶性转化无影响。3.3裸鼠中候选circRNA参与细胞恶性转化验证Hsacirc0006867低表达促进染毒细胞皮下移植瘤、肝脏转移瘤形成,Hsacirc0063865过表达促进染毒细胞皮下移植瘤、肝脏转移瘤形成。4研究结论Hsacirc0063865和Hsacirc0006867参与了亚硝胺联合藻毒素致食管上皮细胞恶性转化,其中Hsacirc0063865发挥癌基因、Hsacirc0006867发挥抑癌基因样作用。第三章参与食管上皮细胞恶性转化circRNA功能分析1研究目的识别Hsacirc0006867、Hsacirc0063865在食管上皮恶性转化中对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡功能的调控。2研究方法2.1 Hsacirc0006867、Hsacirc0063865特征分析利用RNase R耐受实验及放线菌素D抑制实验检测Het-1A细胞中Hsacirc0006867、Hsacirc0063865稳定性,使用FISH及核、质分离实验检测Het-1A细胞中Hsacirc0006867、Hsacirc0063865分布。2.2恶性转化细胞中Hsacirc0006867、Hsacirc0063865功能分析利用慢病毒转染Het-1A-T细胞,构建Hsacirc0006867、Hsacirc0063865稳定高、低表达细胞。利用Transwell、Transwell+基质胶法、Ed U法、Annexin V-APC/7-AAD双染法对细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡功能进行检测。2.3裸鼠移植瘤、转移瘤中Hsacirc0006867、Hsacirc0063865功能分析利用免疫组化对Hsacirc0006867、Hsacirc0063865高、低表达Het-1A-T细胞所形成皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中PCNA及E-cadherin蛋白表达进行检测。3研究结果3.1 Hsacirc0006867、Hsacirc0063865特征分析Hsacirc0006867、Hsacirc0063865主要分布于细胞质,Hsacirc0006867、Hsacirc0063865对RNase R耐受,内源性的Hsacirc0006867、Hsacirc0063865比线性RNA具有更好的稳定性。3.2恶性转化细胞中Hsacirc0006867、Hsacirc0063865功能分析Hsacirc0006867过表达抑制细胞侵袭、迁移、增殖,低表达促进细胞侵袭、迁移、增殖。Hsacirc0063865过表达促进细胞侵袭、迁移、增殖并抑制细胞凋亡,低表达抑制细胞侵袭、迁移、增殖并促进细胞凋亡。3.3裸鼠移植瘤、转移瘤中Hsacirc0006867、Hsacirc0063865功能分析Hsacirc0006867可以抑制皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中PCNA表达并促进E-cadherin表达,Hsacirc0063865可以促进皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中PCNA表达并抑制E-cadherin表达。4研究结论Hsacirc0063865可以促进恶性转化细胞迁移、侵袭、增殖并抑制细胞凋亡,Hsacirc0006867可以抑制恶性转化细胞迁移、侵袭及增殖。第四章候选circRNA参与细胞恶性转化机制分析1研究目的从结合miRNA、结合蛋白分别探讨Hsacirc0063865、Hsacirc0006867参与食管上皮细胞恶性转化的机制,为亚硝胺联合藻毒素致食管癌提供新的理论依据。2研究方法2.1 Hsacirc0063865、Hsacirc0006867结合蛋白分析使用Ch IRP探针钓取细胞中Hsacirc0063865、Hsacirc0006867的结合蛋白,利用液相色谱-质谱联用技术识别结合蛋白,利用RIP实验对结合蛋白进行验证。2.2 Hsacirc0063865、Hsacirc0006867结合miRNA分析分别构建包含Hsacirc0063865、Hsacirc0006867全长序列的双荧光素酶报告基因质粒（Luc/Rluc）,利用双荧光素酶报告基因识别Hsacirc0063865、Hsacirc0006867的结合miRNA及结合位点。2.3 Hsacirc0063865通过e EF1A2/MYH9促进细胞迁移、侵袭利用Co-IP-MS识别与Hsacirc0063865结合的e EF1A2的结合蛋白,利用Co-IP验证识别到的MYH9与e EF1A2的结合,利用RIP检测MYH9是否与Hsacirc0063865直接结合,形成形成Hsacirc0063865-e EF1A2-MYH9复合体。利用Western blot、RTQPCR检测Hsacirc0063865过表达、低表达对e EF1A2、MYH9表达影响,利用siRNA分别干扰MYH9、e EF1A2表达,识别e EF1A2、MYH9的相互调控作用。使用鬼笔环肽染色、Transwell实验检测Hsacirc0063865过表达、低表达对细胞骨架、迁移、侵袭的影响,在Hsacirc0063865过表达细胞中干扰MYH9表达,检测Hsacirc0063865通过MYH9对细胞骨架、迁移、侵袭的调控。利用免疫组化对Hsacirc0063865过表达、低表达裸鼠皮下移植瘤、肝转移瘤、肺转移瘤中MYH9蛋白表达进行检测,利用鬼笔环肽染色、Western Blot对Het-1A、Het-1A-T细胞中MYH9及细胞骨架进行检测,分析Hsacirc0063865-e EF1A2-MYH9对食管上皮细胞恶性转化的调控。2.4 Hsacirc0063865通过Hsa-miR-450b-3p/RCN1调控细胞凋亡利用RNA测序识别与Hsacirc0063865结合的Hsa-miR-450b-3p的靶基因,利用双荧光素酶报告基因、Ago2 RIP验证Hsa-miR-450b-3p与靶基因RCN1结合位点。利用miRNA mimic、inhibitor过表达、干扰Hsa-miR-450b-3p,使用RT-QPCR及Western blot检测Hsa-miR-450b-3p对RCN1的调控,在Hsacirc0063865过表达细胞中过表达HsamiR-450b-3p,检测Hsacirc0063865通过Hsa-miR-450b-3p对RCN1表达的调控。利用Annexin V-APC/7-AAD双染法检测Hsa-miR-450b-3p、Hsa-miR-450b-3p通过RCN1（inhibitor+Si-NC、inhibitor NC、inhibitor+si-RCN1）、Hsacirc0063865通过HsamiR-450b-3p对细胞凋亡的调控。利用Western blot、JC-1染色法检测Hsa-miR-450b-3p、Hsacirc0063865通过Hsa-miR-450b-3p对Het-1A-T内质网应激信号通路（p PERK、p EIF2α、ATF4、CHOP）、线粒体膜电位的调控。利用免疫组化检测Hsacirc0063865过表达、低表达细胞裸鼠皮下移植瘤、肝、肺转移瘤中RCN1、p EIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达,利用Western blot、JC-1染色法检测Het-1A、Het-1A-T中RCN1、p PERK、p EIF2α、ATF4、CHOP表达及线粒体膜电位,分析Hsacirc0063865/Hsa-miR-450b-3p/RCN1在细胞恶性转化中的调控作用。2.5 Hsacirc0006867通过Hsa-miR-499a-3p/MEF2C调控细胞迁移、侵袭利用Western blot检测Het-1A、Het-1A-T中MEF2C表达,分析Het-1A恶性转化中Hsacirc0006867对MEF2C的调控。利用Anti-Ago2 RIP验证Hsa-miR-499a-3p与MEF2C mRNA的结合。利用miRNA mimic、inhibitor过表达、干扰Hsa-miR-499a-3p,使用RT-QPCR、Western blot检测Hsa-miR-499a-3p对MEF2C表达的调控,在Hsacirc0006867过表达细胞中过表达Hsa-miR-499a-3p,检测Hsacirc0006867通过Hsa-miR-499a-3p对MEF2C的调控。使用Transwell法检测Hsa-miR-499a-3p、Hsa-miR-499a-3p通过MEF2C（inhibitor+SiNC、inhibitor NC、inhibitor+si-MEF2C）、Hsacirc0006867通过Hsa-miR-499a-3p对细胞迁移、侵袭的调控。利用免疫组化检测Hsacirc0006867过表达、低表达细胞裸鼠皮下移植瘤、肝、肺转移瘤中MEF2C蛋白表达,识别Hsacirc0006867对移植瘤、转移瘤中MEF2C的调控。3研究结果3.1 Hsacirc0063865、Hsacirc0006867结合蛋白分析Hsacirc0063865可以与e EF1A2特异性结合。3.2 Hsacirc0063865、Hsacirc0006867结合miRNA分析Hsacirc0006867可以竞争性结合Hsa-miR-499a-3p,Hsacirc0063865可以竞争性结合Hsa-miR-450b-3p。3.3 Hsacirc0063865通过e EF1A2/MYH9促进细胞迁移、侵袭Co-IP实验显示e EF1A2可以结合MYH9,RIP实验显示MYH9可以结合Hsacirc0063865,Hsacirc0063865、e EF1A2、MYH9在细胞中以复合体形式存在。Hsacirc0063865过表达可以促进、低表达可以抑制MYH9蛋白表达,Hsacirc0063865对e EF1A2蛋白及MYH9 mRNA表达并无影响。干扰e EF1A2可以降低MYH9蛋白表达,干扰MYH9对e EF1A2蛋白表达无影响。Hsacirc0063865可能引导翻译延伸因子e EF1A2结合MYH9进而促进了MYH9的翻译。Hsacirc0063865高表达可以促进、低表达抑制细胞骨架重排,在Hsacirc0063865高表达细胞中干扰MYH9,紊乱的细胞微丝蛋白排列变得整齐,并出现张力丝结构,细胞的迁移、侵袭能力也随之降低。Hsacirc0063865高表达细胞裸鼠皮下、肝、肺移植瘤中MYH9表达显著升高,Hsacirc0063865低表达细胞裸鼠皮下移植瘤中MYH9表达显著降低。与Het-1A细胞相比,Het-1A-T中MYH9蛋白表达显著上调,细胞微丝蛋白排列紊乱,张力丝结构随之消失。3.4 Hsacirc0063865通过Hsa-miR-450b-3p/RCN1/PERK/CHOP调控细胞凋亡与Hsacirc0063865竞争性结合的Hsa-miR-450b-3p可以竞争性结合RCN1,HsamiR-450b-3p过表达可以抑制、低表达可以促进RCN1表达。Hsacirc0063865过表达细胞中RCN1表达显著升高,过表达Hsa-miR-450b-3p后,Hsacirc0063865过表达不再促进RCN1表达。Hsa-miR-450b-3p过表达可以促进、低表达可以抑制细胞凋亡,在Hsa-miR-450b-3p低表达细胞中干扰RCN1后,Hsa-miR-450b-3p低表达不再抑制细胞凋亡。在Hsacirc0063865过表达细胞中过表达Hsa-miR-450b-3p,Hsacirc0063865过表达不再抑制细胞凋亡。Hsacirc0063865过表达可以抑制内质网应激,p PERK、p EIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低,线粒体膜电位显著升高,过表达Hsa-miR-450b-3p后,Hsacirc0063865过表达不再抑制细胞内质网应激,线粒体膜电位也随之降低。Hsacirc0063865过表达移植瘤、转移瘤中RCN1表达上升,p EIF2α、ATF4、CHOP表达下降,Hsacirc0063865低表达细胞移植瘤、转移瘤中RCN1蛋白表达下降,p EIF2α、ATF4、CHOP表达升高。与Het-1A相比,Het-1A-T中RCN1蛋白表达升高,p PERK、p EIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达降低,线粒体膜电位随之升高。3.5 Hsacirc0006867通过Hsa-miR-499a-3p/MEF2C调控细胞迁移、侵袭与Hsacirc0063865竞争性结合的Hsa-miR-450b-3p可以竞争性结合MEF2C,HsamiR-499a-3p过表达可以抑制、低表达可以促进MEF2C表达,Hsacirc0006867过表达可以促进MEF2C表达,过表达Hsa-miR-499a-3p后,Hsacirc0006867过表达不再促进MEF2C表达。Hsa-miR-499a-3p过表达可以显著促进、低表达可以显著抑制细胞迁移、侵袭,在Hsa-miR-499a-3p低表达细胞中干扰MEF2C后,Hsa-miR-499a-3p低表达不再抑制细胞迁移、侵袭。在Hsacirc0006867过表达细胞中过表达Hsa-miR-499a-3p后,Hsacirc0006867过表达不再抑制细胞迁移、侵袭。Hsacirc0006867过表达裸鼠皮下移植瘤、肝、肺转移瘤中MEF2C蛋白表达显著升高,Hsacirc0006867低表达皮下移植瘤、肝、肺转移瘤中MEF2C蛋白表达显著降低。4研究结论1.Hsacirc0063865作为分子桥梁引导e EF1A2结合MYH9,促进MYH9蛋白翻译,高表达的MYH9导致细胞骨架重排,促进了细胞迁移、侵袭,进而促进细胞恶性转化。2.Hsacirc0063865可以通过Hsa-miR-450b-3p/RCN1/PERK/CHOP抑制细胞内质网应激信号通路,抑制细胞线粒体膜电位去极化,进而抑制细胞凋亡并促进细胞恶性转化。3.Hsacirc0006867可以通过Hsa-miR-499a-3p/MEF2C抑制细胞迁移、侵袭,进而抑制细胞恶性转化。