目的:多发性硬化症（Multiple Sclerosis,MS）是临床最常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病,其发病进展快、高致残、治疗效果差、预后不良,严重影响患者的生存质量。目前临床上采用免疫调节剂进行治疗,此类药物虽能控制MS病情发展,但其不能修复受损的髓鞘。因此,兼具免疫调控和髓鞘修复双重功能的药物发现已成为临床上的研究热点之一。文献报道,巨噬细胞极化与MS发生发展密切相关,可发挥调控炎症反应和修复损伤髓鞘的双重功能,有望成为MS有效治疗的策略之一。本课题采用巨噬细胞筛选发现调控巨噬细胞极化的药物,并研究其对多发性硬化症的治疗作用及其分子机制。方法:1.巨噬细胞M2型极化特异性促进药物的筛选1)原代巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophages,BMDMs）经不同的具有免疫调节作用的药物,包括抗代谢类药物培美曲塞和吉西他滨、抗组胺类药物氯雷他定和异丙嗪、抗5-羟色胺类药物阿扎司琼和帕洛诺司琼、新型免疫调节剂来那度胺和泊马度胺,单独作用作用24h,采用qRT-PCR考察巨噬细胞M2型基因Arg1和Mrc1mRNA及M1型基因iNOS和CXCL10 mRNA的表达变化;2)BMDMs经不同的具有免疫调节作用的药物,包括抗代谢类药物培美曲塞和吉西他滨、抗组胺类药物氯雷他定和异丙嗪、抗5-羟色胺类药物阿扎司琼和帕洛诺司琼、新型免疫调节剂来那度胺和泊马度胺,在IL-13及LPS诱导下作用24h后,采用qRT-PCR考察巨噬细胞M2型基因Arg1和Mrc1mRNA及M1型基因iNOS和CXCL10 mRNA的表达变化;3)BMDMs经不同浓度来那度胺单独作用24h,采用qRT-PCR考察巨噬细胞M2型标记基因Arg1、Ym1、Mrc1、Ccl17 和 Ccl22 mRNA 的表达变化。2.来那度胺对EAE小鼠模型的实验治疗作用构建MOG35₅5诱导拟MS的EAE小鼠模型,每天1次,连续23天灌胃给予不同剂量来那度胺。1)采用Kono’ s法评价EAE各组小鼠临床症状得分,并监测小鼠体重变化;2)采用苏木精-伊红（Hematoxylin&Erosin,HE）染色检测药物治疗后EAE小鼠脊髓炎性变化情况;3)采用免疫荧光技术考察来那度胺给药对EAE小鼠脊髓背部区域星形胶质细胞激活的影响;4)采用免疫荧光技术考察来那度胺给药对EAE小鼠脊髓背部区域小胶质细胞激活的影响;5)采用qRT-PCR、免疫荧光、免疫组化检测来那度胺给药对EAE小鼠少突胶质细胞的影响;6)利用坚牢蓝（Luxol Fast Blue）染色和透射电镜技术评价来那度胺对EAE小鼠髓鞘损伤的影响。3.来那度胺促进巨噬细胞M2型极化的分子机制研究1)采用western blot和免疫荧光技术检测来那度胺给药后,EAE小鼠脊髓和脾脏组织中M2型巨噬细胞标记物Arg1蛋白的表达情况;2)采用qRT-PCR检测来那度胺给药后EAE小鼠的脾脏组织中与巨噬细胞相关的细胞因子mRNA的变化情况;3)采用免疫荧光技术和western blot检测来那度胺给药后EAE小鼠脾脏和脊髓中IL-10蛋白的变化情况;4)采用免疫荧光技术将IL-10分别与CD4、CD8、CD19和CD68共染,考察来那度胺给药所诱导产生的IL-10主要来源;5)不同浓度来那度胺单独作用野生型小鼠和IL-10-/-小鼠来源的BMDMs 24h后,采用qRT-PCR考察巨噬细胞M2型基因Arg1 mRNA的表达情况;6)采用western blot检测来那度胺不同浓度作用RAW264.7细胞后,STAT6,STAT3,AKT和p38的激活情况;7)采用免疫荧光检测p-p38和p-STAT3（Y705）在M2型巨噬细胞中的表达情况。结果:1.巨噬细胞M2型极化特异性促进药物的筛选1)抗代谢类药物对巨噬细胞基因表达的影响培美曲塞（Pemetrexed）单独作用BMDMs24h后,可显著促进Arg1mRNA表达（p<0.05）,但不促进Mrc1 mRA表达,IL-13诱导下其对Arg1和Mrc1 mRNA表达未见有显著性影响。吉西他滨（Gemcitabine）单用或在IL-13的诱导下,对Arg1和Mrc1mRNA表达未见有显著性影响。培美曲塞单独作用BMDMs 24h后,未见M1型巨噬细胞基因iNOS和CXCL10 mRNA表达发生显著性变化,但在LPS诱导下,上调iNOSmRNA水平,存在统计学上的差异性（p<0.05）。吉西他滨单独作用明显增加CXCL10 mRNA水平（p<0.05）,但不影响iNOSmRN表达。在刺激因子LPS诱导下,吉西他滨不影响iNOS和CXCL10 mRNA的表达。以上结果提示,吉西他滨未见能明显促进巨噬细胞M2型基因的表达,培美曲塞单独作用BMDMs仅上调Arg1mRNA水平,但该促进作用有限,仅能较空白对照组1.65倍的增加Arg1 mRNA表达。2)抗组胺类药物对巨噬细胞基因表达的影响组胺受体拮抗剂氯雷他定（Loratadine）单独作用BMDMs 24h,不影响Arg1,Mrc1和iNOS mRNA表达水平,但可显著减少CXCL10mRNA（p<0.05）。在IL-13诱导下,氯雷他定也不影响Arg1 mRNA的表达,但能显著减少Mrc1 mRNA（p<0.05）。氯雷他定未见能显著性减少LPS引起的iNOS及CXCL10 mRNA表达增加。异丙嗪单独作用,或合用IL-13及合用LPS,对Arg1,Mrc1、CXCL10和iNOSmRNA的表达均无显著性影响。以上结果提示,氯雷他定和异丙嗪均未见能显著增加巨噬细胞M2型基因Arg1和Mrc1 mRNA水平。3)抗5-羟色胺类药物对巨噬细胞基因表达的影响阿扎司琼（Azasetron）单独作用BMDMs 24h后,明显减少M2型巨噬细胞基因Arg1 mRNA（p<0.05）,但不影响Mrc1 mRNA的表达。在IL-13诱导下,阿扎司琼反而降低Arg1和Mrc1mRNA的表达（p<0.05）。阿扎司琼单独作用仅减少CXCL10 mRNA（p<0.05）,在LPS诱导下对M1型基因iNOS和CXCL10 mRNA的表达无显著性影响。帕洛诺司琼单独作用BMDMs 24h显著增加Arg1mRNA的表达（p<0.05）,且在IL-13诱导下,可更进一步增加Arg1mRNA的表达,但其对Mrc1mRNA的表达无显著性影响。帕洛诺司琼单独作用BMDMs 24h不能显著减少iNOS和CXCL10 mRNA的表达,但能显著减少LPS引起的CXCL10mRNA的表达增加（p<0.05）。以上结果提示,阿扎司琼未见能显著增加巨噬细胞M2型基因Arg1和Mrc1 mRNA的表达加。帕洛诺司琼单用或合用IL-13仅促进Arg1 mRNA表达,且对巨噬细胞M1型基因iNOS mRNA上调同样显著。4)免疫调节剂对巨噬细胞基因表达的影响来那度胺及泊马度胺单独作用BMDMs 24h后,对巨噬细胞M2型基因Arg1和Mrc1 mRNA的上调作用有限（p>0.05）。在IL-13诱导下,来那度胺显著上调Arg1和Mrc1 mRNA表达水平,存在统计学上的差异性（p<0.05）,而泊马度胺则不具有该作用（p>0.05）。来那度胺单用或合用LPS均未见其明显减少巨噬细胞M1型基因iNOS和CXCL10 mRNA的表达。泊马度胺单用可显著性减少iNOS mRNA表达（p<0.05）。以上结果提示,来那度胺可选择性显著增加巨噬细胞M2型基因Arg1和Mrc1 mRNA的表达,而泊马度胺未见能显著性促进Arg1和Mrc1mRNA的表达。5)来那度胺作用BMDMs对M2型巨噬细胞基因表达的影响来那度胺（25 nM）单独作用BMDMs 24h后,对巨噬细胞M2型基因Ccl17,Ccl22,Arg1,Mrc 和Ym1 mRNA的表达未见显著性影响（p>0.05）。来那度胺（100 nM）单独作用BMDMs 24h后,可明显上调Ym1mRNA（p<0.05）,而对巨噬细胞其他M2型基因的表达无显著性影响。来那度胺（400 nM）单独作用BMDMs 24h后,除不显著增加Ccl22 mRNA表达水平外,能明显增加Cc117,Arg1,Mrc 和Ym1mRNA表达水平（p<0.05）。以上结果提示,来那度胺体外单独作用BMDMs24h后可促进巨噬细胞M2型基因的表达,并具有浓度依赖性,即来那度胺（400 nM）对巨噬细胞M2型相关基因的上调最为显著。2.来那度胺对EAE小鼠模型的实验治疗作用1)来那度胺可减缓EAE疾病进展在EAE模型构建后的第8天,20%左右小鼠出现尾稍疲软症状。第12天EAE小鼠的临床症状得分达到1.94分,小鼠反应迟钝,翻滚身体困难,整个尾巴无力。随着造模时间延长,EAE小鼠开始出现左右摇摆,方向不定,行走不稳等共济失调的症状。在造模后的第18天,EAE小鼠症状加重,出现偏瘫,其临床症状得分达到3分。相对于EAE模型组,阳性药地塞米松可降低EAE平均临床得分,减轻小鼠EAE症状。给药1周（第16天）后该组小鼠症状的临床得分维持在1分,明显低于EAE模型组小鼠的症状得分（2.56分）。来那度胺（30 mg/kg,100 mg/kg）显著降低EAE造模小鼠平均临床得分,给药1周即可降低EAE小鼠症状评分,与阳性药地塞米松效果相当。来那度胺继续给药1周,可缓解EAE小鼠临床症状,扩大与EAE模型组小鼠的得分差距。同时,较EAE模型组小鼠体重波动下降相比,来那度胺治疗给药组小鼠体重相对稳定。实验结束时,给药组小鼠的体重与实验初期时相当,不存在显著性差异。以上结果提示,来那度胺（30 mg/kg,100 mg/kg）治疗给药减缓EAE发病进程,改善EAE造模小鼠的运动功能障碍,并维持EAE小鼠的体重稳定。2)来那度胺抑制EAE小鼠的炎性反应HE染色结果显示,EAE发病急性期（第16天）,模型组小鼠脊髓白质区可见大量的炎性细胞浸润,而来那度胺（30mg/kg,100mg/kg）给药能够剂量依赖地抑制炎性细胞浸润。免疫荧光结果显示,EAE病情早期（第12天）,模型组小鼠脊髓中星形胶质细胞激活明显,其突起增大变粗,数量增加,相互交织呈星状,而小胶质细胞未完全激活;EAE病情发展高峰期（第23天）及慢性稳定期（第31天）,星形胶质细胞和小胶质细胞均活化显著。来那度胺（30mg/kg,100mg/kg）治疗EAE小鼠能持续抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活。以上结果提示,来那度胺抑制炎性胶质细胞活化,抑制炎症反应。3)来那度胺保护少突胶质细胞及髓鞘免疫荧光及免疫组化结果显示,在EAE病情急性期,模型组小鼠脊髓及脑胼胝体区域,少突胶质细胞标记物Olig2及MBP显著减少,而来那度胺给药组未见Olig2及MBP的表达降低。qRT-PCR结果显示,在EAE病情高峰期,模型组小鼠脊髓少突胶质细胞相关基因Olig2 mRNA下调显著,Mbp,Cnp和Sox10 mRNA略有减少;而来那度胺（100mg/kg）可不同程度地增加它们的表达（p<0.05）。免疫荧光结果显示,在EAE发病高峰期,来那度胺（30mg/kg,100mg/kg）均可保护脊髓白质区域中Olig2+少突胶质细胞系和CC1+成熟少突胶质细胞,且显著提高EAE小鼠脊髓白质区CCl+/Olig2比值（p<0.05）。以上结果提示,来那度胺可显著减少EAE小鼠CNS中的少突胶质细胞损伤。LFB染色结果显示,EAE发病急性期模型组小鼠的脊髓白质区着色浅,空泡状改变较多,提示髓鞘丢失。而来那度胺各给药组的小鼠脊髓白质区未见空泡状改变。透射电镜结果进一步表明,EAE发病高峰期模型组小鼠脊髓中髓鞘组织松散、变形、破碎,给予来那度胺后可避免髓鞘破坏,髓鞘形状较完整。利用ImageJ软件统计电镜结果中轴突的内外半径计算g-ratio值,数据显示,EAE模型组小鼠g-ratio值（0.78 ± 0.01 μm）较正常对照组（0.66±0.009μm）显著上调,而来那度胺（30mg/kg,100mg/kg）可以逆转这一上调现象。以上结果提示,来那度胺减轻EAE小鼠的髓鞘损伤。3.来那度胺促进巨噬细胞M2型极化的分子机制研究1)来那度胺体内促进M2型巨噬细胞表达免疫荧光结果显示,EAE病情高峰期,模型组小鼠脾脏中M2型巨噬细胞标记物Arg1显著下降,给予来那度胺后可逆转Arg1蛋白的表达下调,并促进Arg1在脾脏组织中的表达。Western blot实验显示,模型组小鼠脊髓中Arg1显著减少,而来那度胺在EAE发病急性期和高峰期均能明显增加Arg1蛋白的表达。以上结果提示,来那度胺体内可促进M2型巨噬细胞的表达。2)来那度胺调控EAE相关炎症因子表达qRT-PCR结果显示,在EAE发病急性期,EAE模型小鼠脊髓中促炎因子TNF-αmRNA上调不显著,而IL-6和IFN-γ mRNA增加明显,来那度胺可明显抑制其上调,与EAE模型组相比,存在统计学差异性（p<0.05）。与之相反,抑炎因子TGF-β,IL-4和IL-10 mRNA在模型组小鼠脾脏中下降明显,与正常对照组相比存在显著性差异（p<0.05）。来那度胺促进TGF-β,IL-4和IL-10mRNA表达,与EAE模型组相比存在显著性差异（p<0.05）。其中来那度胺给药组IL-10 mRNA表达为EAE模型组表达量的近7倍,为正常对照组的近5倍。以上结果提示,来那度胺显著增加脾脏中抑炎因子TGF-β,IL-4和IL-10 mRNA的表达,同时抑制促炎因子IL-6和IFN-γmRNA的表达。3)来那度胺体内促进IL-10蛋白的表达免疫荧光和western blot结果显示,在EAE疾病急性期（第16天）和高峰期（第23天）,可见EAE模型组小鼠脾脏和脊髓中IL-10蛋白明显减少,来那度胺治疗给药可逆转IL-10蛋白的下降,并在给药2周后（第23天,高峰期）显著增加IL-10蛋白的表达。以上结果提示,来那度胺可逆转因EAE疾病引起的IL-10蛋白下调,促进IL-10蛋白表达。4)来那度胺主要促进IL-10在M2型巨噬细胞中表达免疫荧光共染结果显示,来那度胺给药组脾脏中的IL-10主要与CD19和CD68共表达,IL-10与CD4、CD8共染较少。计数分析IL-10+细胞分别占CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD19+B细胞的百分比,发现来那度胺明显只增加IL-10+细胞占CD68+巨噬细胞的百分比。以上结果提示,来那度胺主要促进IL-10在M2型巨噬细胞中表达5)来那度胺对IL-10-/-小鼠BMDMs中Arg1mRNA表达未见明显影响qRT-PCR结果显示,IL-10-/-小鼠BMDMs中的IL-10 mRNA表达低于野生型小鼠BMDMs,存在统计学上的差异性（p<0.05）,而Arg1 mRNA在二者中的表达水平相当,不存在显著性差异（p>0.05）。来那度胺（400nM）单独作用野生型小鼠BMDMs24h后,可上调ArglmRNA的表达（p = 0.061）。然而,IL-10被敲除后来那度胺上调小鼠BMDMs中Arg1 mRNA表达的作用消失。以上结果提示,来那度胺促进巨噬细胞M2型基因的表达可能与其促进IL-10表达相关。6)来那度胺不影响STAT6和AKT的磷酸化Western blot结果显示,来那度胺不同浓度（6.25,25,100）作用传代巨噬细胞RAW264.7细胞1h后不增加p-AKT（Y473）和p-STAT6（Y641）蛋白的表达。以上结果提示,来那度胺作用传代巨噬细胞RAW264.7细胞不增加AKT和STAT6蛋白的磷酸化。7)来那度胺体外增加p38和STAT3的磷酸化Western blot结果显示,来那度胺不同浓度作用传代巨噬细胞RAW264.7细胞2h后,p38蛋白激活显著,p-p38表达呈浓度依赖性增加。此外,来那度胺作用不同浓度作用RAW264.7细胞3h后,STAT3激活显著,p-STAT3（Y705）显著增加,且具有一定浓度依赖性。以上结果提示,来那度胺增加p38和STAT3的磷酸化。8)来那度胺主要增加M2型巨噬细胞中p38和STAT3的磷酸化免疫荧光结果显示,在EAE发病急性期（第16天）,模型组小鼠脾脏中p-p38和p-STAT3（Y705）蛋白表达增加,但二者与Arg1共定位较少。给予来那度胺后可显著增加p-p38和p-STAT3（Y705）的表达,且大部分p-p38和p-STAT3（Y705）能与M2巨噬细胞标记物Arg1共定位,提示来那度胺增加M2型巨噬细胞的表达与其激活巨噬细胞中的p38和STAT3蛋白相关。以上结果提示,来那度胺主要增加M2型巨噬细胞中p38和STAT3的磷酸化。结论:本课题发现并证实了来那度胺选择性促进巨噬细胞M2型极化,且在EAE小鼠模型中显著抑制炎症反应和保护少突胶质细胞,具有显著的实验治疗多发性硬化症的作用。该作用机制可能是通过增加IL-10的表达,进而激活p38和STAT3,促进巨噬细胞M2型极化,最终抑制EAE小鼠的炎性症状,保护少突胶质细胞及髓鞘。综上所述,本课题阐述了来那度胺通过IL-10/p38//STAT3信号轴激活巨噬细胞M2型极化,治疗多发性硬化症,丰富了巨噬细胞M2型极化在多发性硬化症治疗过程中的分子机制,同时拓宽了来那度胺临床应用的新思路。