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研究背景:心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常之一,可引起心力衰竭和脑卒中,具有很高的致残率。伴随房颤的发生及发展,心房基质进行性改变及心房重构会逐渐加重且难以逆转,这也是房颤经导管消融治疗后易远期复发的原因之一。研究发现心房间质纤维化是房颤患者心房组织普遍存在的病理改变,心房间质纤维化在导致心房结构重构的同时也会引起心房电传导不均匀。因此改善心房间质纤维化不仅可以逆转心房结构重构,而且有助于恢复正常的心房电传导,是从根本上治疗房颤的理想方法。肾素-血管紧张素系统(RAS)激活可促进血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)分泌并作用于心房局部组织,促进心房重构,引起心房基质改变及电传导异常。近来,对房颤患者心房组织进行基因组分析发现自噬相关基因表达升高,心房组织中自噬相关分子表达升高,提示房颤引起的病理性改变可能与自噬异常有关。血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1)是AngⅡ发挥效应的主要受体,研究亦证实AT1受体能调控自噬。我们前期研究结果提示AngⅡ刺激不仅诱导心房成纤维细胞胶原分泌增加,而且激活心房成纤维细胞自噬。因此,我们推测RAS激活后AngⅡ分泌增加,AngⅡ作用于心房局部成纤维细胞,诱导心房成纤维细胞自噬增强和胶原分泌增多,最终导致心房间质胶原沉积异常和心房重构。研究方法:从心脏外科收集32例行人工瓣膜置换手术的患者心房组织及血液,其中窦性心律和持续性房颤各16例。ELISA检测血浆中AngⅡ浓度,Masson染色检测心房间质中胶原沉积情况,Western Blot和PCR分析两组样本中Ⅰ/Ⅲ型胶原(COL-Ⅰ/Ⅲ)及自噬标记分子表达。建立AngⅡ皮下持续灌注的小鼠模型,将45只小鼠随机分为5组:生理盐水对照组(Control),AngⅡ灌注组(AngⅡ),自噬激活组(AngⅡ+Rapa),自噬阻断组(AngⅡ+3-MA)和坎地沙坦治疗组(AngⅡ+Can),4周后心脏超声分析小鼠心功能及心脏结构改变,在体检测各组小鼠的心房有效不应期和房颤诱导发生率。Masson染色及免疫组化检测各组小鼠心房组织中COL-Ⅰ/Ⅲ表达及心房间质胶原沉积情况,免疫荧光标记心房组织中的成纤维细胞并检测成纤维细胞自噬变化。提取原代小鼠心房成纤维细胞并培养,给与AngⅡ刺激,检测成纤维细胞胶原表达情况及自噬活性。进一步分析增强自噬(Rapa)或者阻断自噬(CQ,LY294002)后胶原表达变化。siRNA沉默Beclin-1基因,抑制自噬,检测对心房成纤维细胞胶原分泌的影响。mCherry-GFP-LC3腺病毒转染心房成纤维细胞检测自噬流。Western Blot检测AngⅡ干预下ERK信号通路的变化,并分析阻断ERK(PD98059)信号通路后,AngⅡ诱导的心房成纤维细胞胶原分泌、自噬改变及Akt-mTOR信号通路变化。最后,坎地沙坦(Can)预保护或者siRNA沉默AT1受体,检测AngⅡ诱导的心房成纤维细胞自噬改变及胶原分泌、ERK信号通路及Akt-mTOR信号通路变化。结果:相对于窦性心律者,房颤患者血浆中AngⅡ浓度升高,心房间质胶原沉积显著增加,Ⅰ/Ⅲ型胶原表达显著增高,且自噬增强。AngⅡ诱导心房成纤维细胞COL-Ⅰ/Ⅲ分泌增多,自噬增强;Rapa增强自噬后,COL-Ⅰ/Ⅲ表达进一步增高;CQ或者LY294002阻断自噬均能抑制AngⅡ诱导的COL-Ⅰ/Ⅲ表达增高;siRNA沉默beclin-1基因,同样抑制了 AngⅡ诱导的COL-Ⅰ/Ⅲ表达增高。进一步分析发现,AngⅡ诱导心房成纤维细胞自噬流增强。动物实验结果显示,AngⅡ灌注组和自噬激活组的小鼠心脏肥厚、心功能下降,COL-Ⅰ/Ⅲ表达增高,心腔内电生理检查发现心房有效不应期(AERP)缩短,房颤诱导发生率增高;而自噬阻断组和坎地沙坦治疗组均可逆转上述改变。细胞实验中,AngⅡ诱导心房成纤维细胞ERK磷酸化,当阻断ERK(PD98059)后,不仅减轻了 AngⅡ诱导的胶原分泌,同时也上调了 Akt、mTOR的磷酸化,抑制了心房成纤维细胞自噬增强。坎地沙坦预保护能有效抑制AngⅡ诱导的ERK磷酸化并上调Akt、mTOR的磷酸化,抑制心房成纤维细胞自噬及Ⅰ/Ⅲ型胶原表达。siRNA沉默AT1受体后表现出类似坎地沙坦的效应。阻断ERK信号通路或者干扰AT1受体表达均可减弱AngⅡ诱导的心房成纤维细胞自噬流。结论:房颤患者心房组织中Ⅰ/Ⅲ型胶原表达增高、自噬增强,心房间质纤维化加重。AngⅡ通过AT1受体激活ERK信号通路,进而抑制Akt-mTOR信号通路,最终上调心房成纤维细胞自噬并促进Ⅰ/Ⅲ型胶原表达。抑制心房成纤维细胞自噬可减轻AngⅡ诱导的Ⅰ/Ⅲ胶原表达增高,缓解心房重构,延长AERP,降低房颤诱导发生率。