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天然多糖具有无毒、可再生、生物可降解、易化学修饰等优点,被广泛应用于构建基因/药物递送载体和其他生物医学领域。香菇多糖(LNT)是一类具有三螺旋链构象的β-(1?3)-D-葡聚糖,不仅具有良好的生物安全性和相容性,而且具有抗炎症、抗肿瘤和免疫调节等生物活性。更有趣的是,香菇多糖的链构象可以通过改变溶剂环境在三螺旋链(t-LNT)和无规线团单链(s-LNT)之间进行转变,并且s-LNT在重组过程中可以与均聚脱氧腺嘌呤核苷酸(poly(dA))通过氢键作用形成新的三螺旋大分子复合物(s-LNT/poly(dA))。s-LNT/poly(dA)复合物不仅具有较高的稳定性,而且继承了香菇多糖的生物安全性、相容性和生物可降解性等特点,已被成功用于构建智能、高效的基因载体。但是基于s-LNT/poly(dA)复合物构建的载体于动物活体内的递送效果还没有进行过研究。因此,本论文旨在以s-LNT/poly(dA)复合物为基础构建不同的基因/药物载体,通过动物活体实验评估其效果,并对s-LNT/poly(dA)复合物载体进行优化,进一步拓展香菇多糖和s-LNT/poly(dA)复合物在生物医用领域中的应用。本论文的主要创新包括以下几点:(1)首次将携载功能基因(下调小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)的寡核苷酸)的s-LNT/poly(dA)复合物封装于壳聚糖-海藻酸钠(CA)水凝胶中,通过口服给药成功将功能基因递送至小鼠炎性结肠部位,有效缓解小鼠结肠炎病症;(2)利用高碘酸钠氧化成功制备了具有酸响应性的香菇多糖-阿霉素(LNT-Dox)偶联缀合物,并证明LNT-Dox单链(s-LNT-Dox)可与poly(dA)相互作用形成伸展的链状s-LNT-Dox/poly(dA)复合物;(3)首次通过s-LNT-Dox/poly(dA)-fluorophore复合物载体实现对抗肿瘤药物和荧光分子(fluorophore)的共递送,并证明该复合物可用于小鼠活体成像,同时LNT-Dox偶联缀合物可有效抑制HeLa细胞肿瘤生长,显著降低Dox对小鼠的毒副作用;(4)首次将核酸适配体和阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)引入s-LNT/poly(dA)复合物体系中,并证明它有效提高s-LNT/poly(dA)复合物的细胞摄取。本论文的主要研究内容和结论如下。将s-LNT/poly(dA)复合物基因载体包封于CA水凝胶中靶向治疗小鼠结肠炎病症。通过荧光倒置显微镜、扫描电镜、圆二色谱和荧光光谱等实验确定s-LNT/poly(dA)复合物可以完整均匀地封装于CA水凝胶中,且不论在中性缓冲溶液中还是酸性模拟胃液中均不会发生明显泄漏。体外释放实验表明,CA水凝胶有效保护s-LNT/poly(dA)复合物免遭胃液(pH 1.2)和肠液(pH 7.4)的破坏,同时于炎症性结肠环境下(pH 6.8)释放s-LNT/poly(dA)复合物。小鼠体内分布实验和胃肠道成像实验表明,CA水凝胶对所包载的药物具有保护作用,可防止封装的药物泄漏,从而杜绝药物穿透肠壁膜进入血液循环引起毒副作用;口服给药后,CA水凝胶包载s-LNT/poly(dA)复合物于短时间内转移至肠道,减少胃液对复合物的影响,给药24小时后,包载s-LNT/poly(dA)复合物的CA水凝胶基本被排泄干净。结肠组织冰冻切片免疫荧光分析结果显示,CA水凝胶装载s-LNT/poly(dA)复合物在炎症性结肠部位释放,并被结肠组织细胞有效摄取。体内治疗结肠炎结果表明,包载s-LNT/poly(dA)复合物的CA水凝胶缓解小鼠体重下降和结肠及脾脏的病变,下调小鼠结肠组织中的TNF-α,降低组织中髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量,有效缓解小鼠结肠炎病症。本工作提出一种新颖的口服反义寡核苷酸缓解炎症反应的策略,在靶向治疗肠道炎症疾病方面具有广阔的应用前景。基于香菇多糖?-(1?3)-D-葡聚糖主链和?-(1?6)-D-葡萄糖侧基的特殊键接方式,我们通过席夫碱反应制备了LNT-Dox偶联缀合物,并对s-LNT-Dox与poly(dA)之间的相互作用进行研究。核磁共振波谱、红外光谱和紫外光谱结果表明LNT-Dox偶联缀合物制备成功,其Dox的载药量为6.2%。原子力显微镜(AFM)图像显示,LNT-Dox偶联缀合物具有与LNT一样的链状形貌,但是LNT-Dox更容易聚集形成颗粒。此外,LNT-Dox由于含有酸响应性肟键(-HC=N-),可在酸性条件实现对Dox可控释放。AFM、透射电镜(TEM)、圆二色谱和琼脂糖凝胶电泳实验结果表明,s-LNT-Dox与poly(dA)相互作用形成链状的s-LNT-Dox/poly(dA)复合物。通过细胞实验和动物实验探讨LNT-Dox偶联缀合物的细胞摄取、对HeLa细胞的抑制活性和体内抗肿瘤活性,以及s-LNT-Dox/poly(dA)复合物载体对抗癌药物和荧光分子的共递送效果。结果证明,Dox和荧光分子通过s-LNT-Dox/poly(dA)-fluorophore复合物被同时递送至HeLa细胞内,且s-LNT-Dox/poly(dA)-fluorophore复合物具有较长的体内血液循环时间,并在小鼠肿瘤部位有效聚集,实现小鼠肿瘤荧光成像。LNT-Dox对HeLa细胞的毒性随时间的增长逐渐变强,且LNT-Dox有效抑制小鼠肿瘤的生长,并显著减弱Dox对小鼠的毒副作用。本工作提供了一种将化疗药物和成像试剂结合于同一平台的安全有效的策略,在构建肿瘤诊疗纳米材料中显示出巨大潜力。通过引入核酸适配体和PEI提高s-LNT/poly(dA)复合物体系的细胞摄取效率。圆二色谱结果表明,在poly(dA)尾端键接核酸适配体AS1411并不影响其与s-LNT的相互作用;同时,在LNT上接枝异硫氰酸荧光素(FITC)得到具有荧光性质的LNT-FITC,LNT-FITC单链(s-LNT-FITC)与poly(dA)-AS1411相互作用形成s-LNT-FITC/poly(dA)-AS1411复合物。共聚焦显微镜和流式细胞术实验表明,AS1411有效增强s-LNT/poly(dA)和s-LNT-FITC/poly(dA)复合物的细胞摄取。除了AS1411,核酸适配体MUC1也增强s-LNT-FITC/poly(dA)复合物的细胞摄取,而且该复合物的细胞摄取随着核酸适配体浓度增加而增强。圆二色谱结果表明,PEI的引入不影响s-LNT/poly(dA)复合物的稳定性。细胞实验证明,PEI的加入显著提高s-LNT/poly(dA)复合物的细胞摄取,而且s-LNT与poly(dA)相互作用形成s-LNT/poly(dA)-FAM复合物是引入PEI提高复合物体系细胞摄取的必要条件。同时,PEI对s-LNT-FITC/poly(dA)-AS1411复合物体系的细胞摄取也具有明显的促进作用。本工作提出一种有效提高s-LNT/poly(dA)复合物细胞摄取的方法,将大大促进s-LNT/poly(dA)复合物体系在生物医用领域中的应用。综上所述,本论文基于s-LNT/poly(dA)复合物构建了用于治疗结肠炎的基因载体,以及同时递送抗癌药物和荧光成像分子的诊疗载体,并通过引入核酸适配体和聚阳离子提高了s-LNT/poly(dA)复合物体系的细胞摄取。本论文极大地拓展了s-LNT/poly(dA)复合物的应用范围,为香菇多糖在生物医用领域的应用提供了科学依据,具有重要的学术价值和应用前景。