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目的羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒引起绵羊和山羊的一种接触性人畜共患的传染病,该病在世界范围内广泛存在,严重地危害了养羊业的发展和人类的健康。本研究拟对上海崇明地区羊口疮病毒进行分离鉴定,对分离毒株的重要基因进行序列分析,以期确定该地区羊口疮流行株的特征;以其为目的基因构建羊口疮重组腺病毒,对其进行免疫学评价,为羊口疮核酸疫苗的研制奠定理论基础。方法采集上海崇明地区疑似羊口疮病毒感染的羔羊唇部结痂组织,应用PCR、MDBK细胞分离培养、电子显微镜观察、间接免疫荧光等技术进行病毒的分离鉴定,并对两株上海分离毒株保护性抗原基因F1L、B2L基因进行克隆与序列分析、构建系统进化树。应用PCR扩增ORFV-F416毒株的F1L、B2L目的基因,构建重组腺病毒穿梭质粒,穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK-293细胞,包装出ORFV重组腺病毒。将重组腺病毒感染MDBK细胞,以Karber法测定病毒效价,采用PCR、IFA和Western-blotting对重组腺病毒进行表达检测,同时免疫接种小鼠,通过免疫指标的检测和攻毒保护试验进行免疫效果评价。结果1、成功分离到两株ORFV,分别命名为ORFV-F416和ORFV-F429。两株分离株F1L基因与参考毒株核苷酸序列同源性为95.2%99.4%,推导氨基酸序列与参考毒株氨基酸同源性为94.4%99.4%,且在4446位没有氨基酸缺失,遗传进化树分析均显示两株均属于同一分支,且与福建株FJ-YX（KC568410）亲缘关系最近。两株分离株B2L基因与其参考毒株核苷酸序列的同源性分别为96.7%99.6%,推导氨基酸序列与参考毒株氨基酸同源性为94.7%98.9%,与广西株（JQ904793）同源性最高,且与疫苗株亲缘关系较远。两分离株间F1L、B2L基因核苷酸序列同源性分别为99.9%和99.0%。2、成功获得pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP重组腺病毒,其TCID50为10-5.375/mL,并通过PCR、IFA和Western-blotting检测证实,目的基因在基因及蛋白水平上均有表达。羊口疮重组腺病毒免疫小鼠后,与对照组和空载体组相比,第1周,重组腺病毒组IgG抗体水平显著增高,第2、3、4周,差异均极显著（P<0.01）,第4周时达到峰值,第5周后开始下降。无刺激、非特异性和特异性刺激后,重组腺病毒组的淋巴细胞增殖能力均显著增加（P<0.01）,攻毒试验的保护率为80%。表明羊口疮重组腺病毒能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,具有良好的免疫原性。结论1、在上海崇明地区成功地分离到ORFV-F416和ORFV-F429两株ORFV,两分离株的F1L基因和B2L基因存在一定变异,且与我国南方地区流行毒株亲缘关系较近。2、成功构建的羊口疮重组腺病毒能够促使小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,为羊口疮的疫苗研制奠定基础。