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背景线粒体钙稳态在细胞病理生理过程中起着一系列关键作用,包括细胞能量代谢,细胞凋亡和活性氧(ROS)的产生,线粒体钙稳态失衡更是在肿瘤恶性进展中扮演了关键角色。然而,线粒体钙稳态在结直肠癌进展中的功能作用并不清楚。我们前期研究发现:线粒体钙单向转运体MCU的表达水平在结直肠癌组织中异常升高,且与结直肠癌患者的不良预后相关;上调MCU表达能够加速细胞增殖从而促进结直肠癌细胞生长。且有研究报道,线粒体转录因子TFAM的去磷酸化状态促进TFAM的稳定,线粒体生物发生显著上调。在此基础上,我们进一步提出科学假说:MCU介导的线粒体钙紊乱有可能通过影响线粒体内酶活性,调控TFAM的磷酸化状态,从而导致线粒体生物发生异常,最终促进结直肠癌的恶性进展。目的探索MCU介导的线粒体钙稳态重塑调控结直肠癌生长的作用与机制。方法1.免疫组化分析MCU的表达及其与结直肠癌患者预后的关系。2.利用免疫组化和透射电镜分析结直肠癌组织中MCU与线粒体生物发生的相关性。3.利用公共数据库分析结直肠癌组织中MCU与线粒体生物发生的相关性。4.利用靶向线粒体基质的钙结合蛋白mitopericam分析MCU对结直肠癌细胞的线粒体钙离子水平作用。5.利用实时定量q PCR,Western Blot,共聚焦三维重构,ATP试剂盒以及透射电镜等实验方法分析MCU对线粒体生物发生的影响。6.利用蛋白质免疫印迹检测线粒体转录因子TFAM蛋白及其磷酸化水平,分析MCU对结直肠癌细胞线粒体转录因子TFAM蛋白及其磷酸化水平的影响。7.利用酶活性检测试剂盒检测线粒体PDE2A酶和PKA激酶活性,分析MCU介导的线粒体钙稳态促进线粒体生物发生的作用机制。8.利用MTS、Ed U、Annexin V-FITC/PI,分析MCU对结直肠癌细胞生长的影响。9.利用动物实验,体内分析MCU对结直肠癌生长的影响。结果第一部分:通过免疫组化分析结直肠癌样本MCU的表达水平,发现其表达水平明显高于癌旁组织,并且与结直肠癌患者的预后不良相关。通过MTS、Ed U实验进行分析,发现MCU可促进结直肠癌细胞的增殖。第二部分:通过免疫组化和透射电镜进行分析,发现MCU表达水平与线粒体生物发生指标呈正相关。通过公共数据库GEO分析,发现MCU表达水平与线粒体生物发生相关分子表达水平呈正相关。通过转染靶向线粒体基质的钙结合蛋mitopericam检测线粒体钙,发现MCU能够介导线粒体钙水平升高。通过q PCR检测mt DNA拷贝数;Western Blot检测线粒体氧化磷酸化核心亚基蛋白水平(ND1,SDHB,UQCRC2,MTCOX2,ATP5A1);通过共聚焦三维重构检测线粒体质量mass;通过ATP试剂盒检测线粒体ATP产量,发现MCU介导的线粒体钙水平升高促进线粒体生物发生。第三部分:通过检测线粒体转录因子TFAM蛋白及其磷酸化水平,发现MCU能够增加结直肠癌细胞线粒体转录因子TFAM去磷酸化水平。通过组成型活化TFAM磷酸化,以及组成型抑制TFAM磷酸化,发现MCU介导的线粒体钙水平升高通过增加TFAM去磷酸化水平,促进线粒体生物发生。通过检测线粒体PDE2A酶和PKA激酶活性,发现MCU能够激活PDE2A酶活性,从而增加线粒体转录因子TFAM蛋白及其去磷酸化水平。第四部分:通过采用MTS测定细胞生长曲线、Ed U检测细胞增殖、Annexin V-FITC/PI凋亡等实验方法,发现MCU通过TFAM促进线粒体生物发生从而促进结直肠癌细胞增殖。通过体内动物实验,证实MCU通过TFAM调控线粒体生物发生促进结直肠癌生长。结论MCU介导结直肠癌线粒体钙水平升高,激活线粒体PDE2A酶活性,从而增加线粒体转录因子TFAM去磷酸化,调控线粒体生物发生促进结直肠癌生长。