线粒体钙稳态重塑通过调控线粒体生物发生促进肠癌生长的作用及机制研究

来源 :中国人民解放军空军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:itismewhq
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背景线粒体钙稳态在细胞病理生理过程中起着一系列关键作用,包括细胞能量代谢,细胞凋亡和活性氧(ROS)的产生,线粒体钙稳态失衡更是在肿瘤恶性进展中扮演了关键角色。然而,线粒体钙稳态在结直肠癌进展中的功能作用并不清楚。我们前期研究发现:线粒体钙单向转运体MCU的表达水平在结直肠癌组织中异常升高,且与结直肠癌患者的不良预后相关;上调MCU表达能够加速细胞增殖从而促进结直肠癌细胞生长。且有研究报道,线粒体转录因子TFAM的去磷酸化状态促进TFAM的稳定,线粒体生物发生显著上调。在此基础上,我们进一步提出科学假说:MCU介导的线粒体钙紊乱有可能通过影响线粒体内酶活性,调控TFAM的磷酸化状态,从而导致线粒体生物发生异常,最终促进结直肠癌的恶性进展。目的探索MCU介导的线粒体钙稳态重塑调控结直肠癌生长的作用与机制。方法1.免疫组化分析MCU的表达及其与结直肠癌患者预后的关系。2.利用免疫组化和透射电镜分析结直肠癌组织中MCU与线粒体生物发生的相关性。3.利用公共数据库分析结直肠癌组织中MCU与线粒体生物发生的相关性。4.利用靶向线粒体基质的钙结合蛋白mitopericam分析MCU对结直肠癌细胞的线粒体钙离子水平作用。5.利用实时定量q PCR,Western Blot,共聚焦三维重构,ATP试剂盒以及透射电镜等实验方法分析MCU对线粒体生物发生的影响。6.利用蛋白质免疫印迹检测线粒体转录因子TFAM蛋白及其磷酸化水平,分析MCU对结直肠癌细胞线粒体转录因子TFAM蛋白及其磷酸化水平的影响。7.利用酶活性检测试剂盒检测线粒体PDE2A酶和PKA激酶活性,分析MCU介导的线粒体钙稳态促进线粒体生物发生的作用机制。8.利用MTS、Ed U、Annexin V-FITC/PI,分析MCU对结直肠癌细胞生长的影响。9.利用动物实验,体内分析MCU对结直肠癌生长的影响。结果第一部分:通过免疫组化分析结直肠癌样本MCU的表达水平,发现其表达水平明显高于癌旁组织,并且与结直肠癌患者的预后不良相关。通过MTS、Ed U实验进行分析,发现MCU可促进结直肠癌细胞的增殖。第二部分:通过免疫组化和透射电镜进行分析,发现MCU表达水平与线粒体生物发生指标呈正相关。通过公共数据库GEO分析,发现MCU表达水平与线粒体生物发生相关分子表达水平呈正相关。通过转染靶向线粒体基质的钙结合蛋mitopericam检测线粒体钙,发现MCU能够介导线粒体钙水平升高。通过q PCR检测mt DNA拷贝数;Western Blot检测线粒体氧化磷酸化核心亚基蛋白水平(ND1,SDHB,UQCRC2,MTCOX2,ATP5A1);通过共聚焦三维重构检测线粒体质量mass;通过ATP试剂盒检测线粒体ATP产量,发现MCU介导的线粒体钙水平升高促进线粒体生物发生。第三部分:通过检测线粒体转录因子TFAM蛋白及其磷酸化水平,发现MCU能够增加结直肠癌细胞线粒体转录因子TFAM去磷酸化水平。通过组成型活化TFAM磷酸化,以及组成型抑制TFAM磷酸化,发现MCU介导的线粒体钙水平升高通过增加TFAM去磷酸化水平,促进线粒体生物发生。通过检测线粒体PDE2A酶和PKA激酶活性,发现MCU能够激活PDE2A酶活性,从而增加线粒体转录因子TFAM蛋白及其去磷酸化水平。第四部分:通过采用MTS测定细胞生长曲线、Ed U检测细胞增殖、Annexin V-FITC/PI凋亡等实验方法,发现MCU通过TFAM促进线粒体生物发生从而促进结直肠癌细胞增殖。通过体内动物实验,证实MCU通过TFAM调控线粒体生物发生促进结直肠癌生长。结论MCU介导结直肠癌线粒体钙水平升高,激活线粒体PDE2A酶活性,从而增加线粒体转录因子TFAM去磷酸化,调控线粒体生物发生促进结直肠癌生长。
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