凋亡和坏死对胚胎发育及维持淋巴系统动态平衡起关键作用。既往研究表明敲除小鼠外源性凋亡途径中的Fas基因可导致淋巴增殖性疾病，而其下游基因FADD、Caspase8和cFLIP基因敲除的纯合子小鼠则不能得以出生，常在孕10.5天时死胎。这种孕中期死亡由另一种类似于坏死的细胞死亡引起。进一步研究发现这种坏死与RIP1有关，即在FADD基因敲除基础上同时敲除RIP1基因，能使胚胎小鼠存活至出生，且大小、外观与野生型小鼠无差别。而Caspase8可阻止RIP3介导的坏死，同时敲除Caspase8、RIP3可使小鼠出生,且随着年龄的增长出现淋巴增殖性疾病，表现为全身的淋巴结及脾脏较野生型对照小鼠明显增大。FADD对RIP3介导的坏死的抑制作用也已经在小肠上皮细胞上得到证实。在T淋巴细胞功能方面，条件性FADD基因敲除的小鼠的T淋巴细胞对TCR介导的增殖反应不良，但在同时敲除RIP1基因后T淋巴细胞增殖能力得到纠正。而RIP3的敲除也使Caspase8敲除的T淋巴细胞功能得到纠正。有研究表明RIP3能够与RIP1相互作用，表明两者具有相似的作用。既然RIP1的缺失能够纠正FADD缺失导致的胚胎死亡及T淋巴细胞增殖功能障碍，RIP3与RIP1有相似的作用，我们推测RIP3的缺失也能够纠正FADD缺失导致的胚胎死亡及T淋巴细胞增殖功能障碍，为验证上述假说，进一步证实上述凋亡和坏死途径的FADD、RIP3蛋白相互作用关系是否成立，为临床上淋巴增殖性疾病及肿瘤的治疗提供新的探索方向，本文进行了以下研究：一、将FADD+/-RIP3+/-双重杂合子小鼠杂交获得FADD/RIP3双重基因敲除小鼠DKO将6周龄大小FADD+/-RIP3+/-双重杂合子异性小鼠置于同一笼内，每天早晨检查阴道栓，结果发现小鼠能够正常受孕，小鼠出生后3周断奶并剪尾，提取DNA，PCR确定基因型，多次传代得到DKO小鼠。Western blot法确定小鼠的淋巴器官已达到FADD、RIP3的双重敲除。将基因型检测结果进行统计分析，结果表明该双重基因敲除DKO小鼠的出生符合孟德尔规律，能够正常出生、成长，监测该种小鼠的体重、进食、活动、生殖行为与对照小鼠无明显差别。该结果说明基因敲除RIP3，能够完全逆转FADD缺失导致的小鼠胎儿的组织坏死，保证胚胎顺利发育。不同于FADD/RIP1双重基因敲除小鼠出生后即死亡于围生期，FADD/RIP3双重基因敲除小鼠出生后可存活且顺利生长。说明在生理情况下，FADD蛋白对RIP3的引起坏死功能有制约作用。该结果未见FADD-/-RIP3+/+和FADD-/-RIP3+/-小鼠，再次证实FADD-/-小鼠不能出生，与既往的研究相符。另外，该实验三种基因型的交配模式中不论FADD为何种基因型均可见到RIP3-/-子代小鼠的出现，也符合既往的研究，即RIP3基因敲除的小鼠能够正常出生并成长，其T淋巴细胞也无增殖缺陷。总结该部分实验， RIP3的敲除纠正了FADD敲除小鼠在孕10.5天时的死胎，首次获得了FADD/RIP3双重基因敲除小鼠，该双重基因敲除小鼠的子代能顺利按孟德尔规律出生及成活，为深入研究该两种蛋白功能奠定了基础。二、小鼠的淋巴细胞亚群分析随着小鼠年龄的增长，我们观察到双重基因敲除小鼠出现淋巴增殖性疾病，与同窝的对照小鼠相比较，表现为明显增大的淋巴结和脾脏。脾的重量一般为对照小鼠的5-6倍。不但淋巴器官体积大、重量大，其含有的淋巴细胞数亦较对照小鼠明显增多，脾脏细胞数一般在对照小鼠的6倍左右，淋巴结细胞计数最多可达对照小鼠的10-12倍。为明确分析该种小鼠中淋巴细胞亚群情况，我们分别将小鼠的淋巴结、脾脏、胸腺细胞行CD3-PE及B220-TC染色，流式细胞仪分析。结果显示该种DKO小鼠的淋巴结、脾脏中出现一个CD3及B220双阳性的异常淋巴细胞群，与对照组比较差异非常明显。胸腺中该群细胞仅轻度增多。为进一步明确该种细胞的CD4CD8表达情况，将其T细胞再次进行CD4-PE、CD8-TC染色并流式细胞仪分析，从结果中可以看到DKO小鼠单阳性的CD4、CD8细胞比例少于对照小鼠，而CD4、CD8双阴性细胞较对照小鼠增多。明确了DKO小鼠的异常增多的细胞群表型为：CD3、B220双阳性，CD4、CD8双阴性。进一步对该群细胞进行淋巴细胞激活标志的染色，结果表明，不论在淋巴结或是脾脏， CD69表达增高，而CD25、 CD28和CTL-A4的表达两组之间无明显差异。用免疫荧光法检测小鼠血清中抗核抗体情况，1:40稀释小鼠血清，100倍荧光共轭显微镜观察结果，可以看到DKO小鼠荧光强度明显强于对照组小鼠。且随着年龄的增加，DKO小鼠的荧光强度逐渐增强，在6个月时达到最强。该部分实验结论对于淋巴增殖性疾病的发病机制研究提供新的方向，并为治疗提供新的靶点。三、小鼠的T淋巴细胞功能分析通过磁珠法将小鼠T淋巴细胞分离，3H掺入法和CellTrace法检测T淋巴细胞增殖功能。分析表明T淋巴细胞的TCR介导的增殖功能在年轻双重基因敲除小鼠较对照组增强，在相对年老的双重基因敲除小鼠有所减弱。进一步通过研究DKO小鼠胸腺细胞的杀伤情况及外周T淋巴细胞的AICD来明确T细胞死亡情况。通过anti-Fas杀伤胸腺细胞后PI染色，流式细胞仪分析T淋巴细胞的死亡情况。结果表明年轻、年老DKO小鼠胸腺细胞均表现为对抗Fas抗体诱导的杀伤的抵抗；将外周T淋巴细胞经抗CD3抗体活化后再用抗Fas抗体、TNFR1、抗CD3抗体诱导激活诱导的细胞死亡（AICD）情况，结果表明DKO小鼠的T淋巴细胞死亡情况与野生对照及RIP3-/-对照无差别，但低于FADD-/-的小鼠的T细胞死亡情况。该部分实验说明RIP3的缺失成功纠正了小鼠FADD缺失导致的T淋巴细胞增殖缺陷，且该DKO小鼠的胸腺细胞对抗Fas抗体诱导的杀伤有抵抗作用。总结该实验，RIP3的敲除纠正了FADD缺失小鼠在孕10.5天时的死胎，使双重基因敲除小鼠的子代能顺利按孟德尔规律出生及成活，RIP3的缺失也纠正了FADD缺失所致的T淋巴细胞增殖不良。双重基因敲除小鼠的胸腺T细胞对抗Fas抗体诱导的死亡表现为抵抗，对抗Fas抗体、TNFR1、抗CD3抗体诱导的AICD与野生对照无差别。通过将DKO小鼠T细胞增殖及死亡功能分析，表明DKO小鼠发生淋巴细胞堆积的主要原因是细胞死亡减少，推测死亡减少的原因为FADD、RIP3的缺失同时阻断了凋亡和坏死两条死亡信号传导通路，导致细胞永生化生长。该研究为阐明FADD、RIP3在死亡通路上的作用及相互关系提供了新的思路。