碱性磷酸酶（ALP）是一种能够从多种生物分子如核酸，蛋白质，生物碱等中去除其磷酸基团的水解酶。ALP的催化反应能将DNA末端的磷酸基团修复成羟基。ALP在基因转导，细胞代谢以及神经元作用等许多生物进程中扮演了重要的作用。三磷酸腺苷（ATP）是生物体中的重要基质，是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，被誉为细胞内能量的“分子货币”。ATP在细胞新陈代谢和生化过程的调控中扮演了重要的角色。因此，研究高灵敏和高选择性的ALP和ATP的检测方法对于生化分析和临床诊断非常重要。非标记检测法由于具有快速简便成本低的特点而备受关注。SYBR Green I（SG）是最常用的一种DNA嵌入染料，具有良好的光物理性质、热稳定性以及高灵敏度，被广泛用于分子检测。但该方法存在非特异性吸附导致的高背景的缺陷，因而降低了信背比和灵敏度。目前，基于氧化石墨烯（GO）的传感平台已经广泛应用于一系列的分析物检测。这归因于GO独特的吸附DNA以及很强的淬灭荧光的能力。有关文献报道了GO作为有效的信背比增强剂用于非标记分析检测中。综上所述，在查阅已有的文献基础上，本文构建了一系列新型的非标记荧光生物传感器用于检测磷酸酶和生物小分子。具体的工作内容如下：在第二章中，发展了一种非标记、简单、信号增强型，利用SYBR Green I（SG）辅助信号放大的荧光生物传感器用于检测碱性磷酸酶（ALP）。该策略基于ALP将磷酸化的DNA去磷酸化为羟基从而阻碍λ外切酶（λ exo）的作用，荧光染料SG与单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）结合作用的差异的原理，实现荧光检测。我们的方法简单、灵敏度高、选择性好，并且能够成功地用于分析复杂生物样本中的目标物。分析结果表明该方法可以对目标物ALP进行特异性定量分析，线性范围是0.4-200U/mL，检测限是0.05U/mL。在第三章中，发展了一种基于发夹引物和聚合酶延伸的氧化石墨烯（GO）传感新平台检测DNA3′磷酸酶。我们设计了一条3′磷酸化的发夹引物（HP）作为DNA3′磷酸酶的底物链。当DNA3′磷酸酶将磷酸基团水解为羟基，去磷酸化的HP在Klenow片段聚合酶（KF polymerase）的作用下发生聚合延伸，形成很长的双链产物。荧光染料SG会选择性嵌入双链DNA中，产生很强的荧光。此外，GO对没有发生聚合延伸的HP的荧光有很强的淬灭作用，因此可以进一步提升信背比。此设计方法简单便捷的同时具有很高的灵敏度以及很好的选择性。该方法成功用于检测两种DNA3′磷酸酶—T4多核苷酸磷酸酶（PNKP）和小虾碱性磷酸酶（SAP）的活性。我们还研究了抑制剂对这两种酶的抑制作用。分析结果表明该方法可以对T4PNKP和SAP进行高灵敏定量分析，检测限分别是0.07U/mL和0.003U/mL，为应用到DNA损伤修复机制的研究提供了可观的前景。在第四章中，发展了一种基于连接反应和氧化石墨烯与Exo Ⅲ辅助的，SG作为荧光输出信号的非标记荧光分析方法来检测ATP。该方法依据核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）对不同底物不同的切割能力以及GO优先结合单链DNA而非双链DNA的原理。通过结合SG和GO的独特性质，该传感器展现了对ATP分析很高的灵敏度，线性范围是1-200nM，检测限是0.2nM。该方法简单便捷，成本低，为设计新型的荧光生物传感器用于检测ATP提供了新的方向。