论文部分内容阅读
速效胰岛素是一类通过基因工程方式获得的单体胰岛素,具有起效快,安全性高等优点,是新型胰岛素类似物的一种。本论文通过基因工程方法制备两种单体速效胰岛素。论文包括两个部分,第一部分是利用内含肽介导的大肠杆菌表达系统制备单体人胰岛素B22D(B22D-DesB30-insulin);第二部分是利用毕赤酵母表达系统制备单体人胰岛素B27K-DTrI前体B27K。人胰岛素B22D是将人胰岛素B链22位精氨酸突变为天冬氨酸后得到的具有单体性质的人胰岛素类似物。我们采用pTWIN1-IMPACT表达系统,经过几丁质亲和纯化及内含肽自身剪切获得人胰岛素B22D前体的方法,操作简单,快捷。在实验中,我们摸索得到的最优剪切条件是25℃,在不含尿素的缓冲液(pH5.5)中剪切6天。剪切反应结束后,调节缓冲液pH至8.0继续混合2小时可增加剪切液中人胰岛素B22D前体的含量。前体蛋白经胰蛋白酶酶切(pH8.0,37℃,60min)获得的产物通过HPLC纯化及质潜鉴定证实为人胰岛素B22D。最终,人胰岛素B22D产量为0.621mg/LB27K-DTrI是2005年由丁金国等人利用毕赤酵母表达系统制备的速效人胰岛素,具有单体性质好,生物活性高等优点。但由于B27Lys DTrI在毕赤酵母中表达量较低影响其进一步的生产应用。有研究表明胰岛素前体的自身聚合性质有利于前体的稳定表达,从而可以提高蛋白在酵母中的表达量。因此,我们利用单点突变的方法将胰岛素B链27位替换为赖氨酸。这样的设汁既保留了原有的B链末端,又可以通过胰蛋白酶酶切的方式获得B27K-DTrI。希望通过这一方法得到的B27Lys DTrI前体(B27K)在毕赤酵母中的产量能够得到提高,达到最终获取足够的单体速效胰岛素的目的。在工作中,我们筛选到了一株高拷贝、高表达的B27K菌株(S菌株)。对培养条件进行优化实验,得到了5L发酵罐的最优培养条件为pH5.0,温度25℃,诱导108小时。在优化培养条件下,前体蛋白B27K表达量可达114mg/L,高于原有的B27K-DTrI前体表达量。通过一系列纯化方法(疏水作用层析、凝胶过滤层析、离子交换层析和HPLC得到的B27K前体蛋白经质谱鉴定其分子量与理论分子量一致。