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利用植物来源的木质纤维素原料替代石油等化石原料生产燃料和化学品,是缓解资源、能源、环境危机,促进人类社会可持续发展的重要途径。将木质纤维素降解为可发酵糖的纤维素酶使用成本过高,是上述技术最为突出的难点之一。由于木质纤维素成分和结构复杂,需要几十种酶的协同作用进行降解,常用的蛋白表达宿主难以发挥作用,因此目前工业纤维素酶制剂的发酵生产主要使用天然具有较高纤维素酶分泌能力的木霉、青霉等丝状真菌。构建具有高产纤维素酶能力的菌株,对于低成本生产纤维素酶、建立大规模经济性的木质纤维素生物转化体系具有重大意义。丝状真菌木质纤维素降解酶的产量主要在酶编码基因的转录层面受到调控。具体来说,数十个纤维素酶、半纤维素酶基因的转录共同受到葡萄糖等易利用碳源的阻遏,以及纤维素类物质（包括一些纤维素降解产物类似物）的诱导。目前已知这一过程涉及多个转录调控因子（ClrB、XlnR等激活因子,以及CreA、ACEI等抑制因子）的组合作用。对真菌纤维素酶的转录调控机制开展深入研究,有助于加深对微生物介导的自然界碳循环过程的认识,同时可为菌株的理性改造提供有效靶点,加快纤维素酶生产菌株的改良。本论文的主要研究结果如下:1.转录因子ClrB激活木质纤维素降解酶表达的机理研究鉴定了 ClrB对草酸青霉木质纤维素降解酶的表达的激活作用,发现纤维素诱导条件下clrB的缺失菌株中纤维素酶和半纤维素酶的产量呈现严重降低,而clrB回补菌株则能恢复产酶能力。探索了 ClrB对纤维素酶表达激活的剂量效应,发现clrB的组成型过表达能够显著提高菌株在诱导碳源中的纤维素酶产量。使用筛选的核糖体蛋白S8e强启动子在gpdA（p）::clrB菌株中启动clrB的过表达能够继续提高纤维素酶的表达量。在高产木质纤维素降解酶菌株中通过增加clrB的表达剂量构建得到RE-27菌株,木质纤维素降解酶产量得以继续提高。对ClrB的功能结构域进行了鉴定,初步探索了 ClrB接受上游信号的活性调节域。通过组成型过表达ClrB的一系列删截突变体,并在无碳源条件下测定菌株的胞外纤维素酶活力,发现ClrB蛋白中第146-173位和第174-201位序列缺失时,ClrB突变体过表达菌株能够不依赖于纤维素的诱导而分泌纤维素酶。鉴定了ClrB的转录激活域,发现当酿酒酵母转录因子Gal4的DNA结合域与ClrB蛋白第685-780位序列嵌合时能够激活报告基因的表达。探究了clr 和bgl2的遗传相互作用,发现ClrB调控bgl2基因的表达,bgl2的缺失不影响clrfB的表达,但是bgl2的缺失造成的纤维素酶产量的提高依赖于ClrB的存在。发现bgl2敲除和clrB过表达双基因操作对草酸青霉纤维素酶表达的促进作用具有累加效果,同时使纤维素酶的表达摆脱了对诱导物的依赖。2.转录因子XlnR的活性改造对木质纤维素降解酶表达的影响研究鉴定了 XlnR对草酸青霉半纤维素酶表达的激活作用,发现诱导条件下xlnR的缺失会造成半纤维素酶表达的严重降低,xlnR的组成型过表达会使半纤维素酶产量增加。探索了 XlnR蛋白中第871位丙氨酸突变为缬氨酸之后对木质纤维素降解酶表达调控作用的影响,发现XlnRA871V在纤维素、木聚糖等诱导物存在时均能提高木质纤维素降解酶,尤其是半纤维素酶的表达,同时能够增加非诱导条件下半纤维素酶的本底表达量。以M12菌株为出发菌株,通过两步操作构建了高产木质纤维素降解酶菌株RE-8。首先通过一步敲除creA和过表达clrB构建了 RE-6菌株,木质纤维素降解酶产量显著提高。进而在RE-6菌株中表达xlnRA871V、纤维素酶基因cbhl和egl,构建了 RE-8菌株,实现了木质纤维素降解酶产量的继续提高。RE-8菌株与之前构建的具有高产木质纤维素降解酶能力的RE-10菌株比较,滤纸酶活力基本持平,外切酶活力、内切酶活力、半纤维素酶活力均有不同程度的提高。3.嵌合转录因子CXC激活木质纤维素降解酶表达的研究将ClrB的DNA结合域和XlnRA871V的活性调节域和转录激活域组装,构建了嵌合因子CXC-S和CXC-L。探究了不同碳源培养条件下嵌合转录因子对木质纤维素降解酶表达的调控作用,发现纤维素和木聚糖均能诱导两嵌合因子激活木质纤维素降解酶的表达,且木聚糖的诱导作用更强,该条件下嵌合转录因子过表达菌株的木质纤维素降解酶产量更高。发现两嵌合因子的过表达均能改变木质纤维素降解酶的本底表达模式,无碳源培养时菌株仍能够表达木质纤维素降解酶。发现两嵌合转录因子均不能使木质纤维素降解酶的表达摆脱葡萄糖阻遏,但CXC-S能够在木糖培养条件下激活木质纤维素降解酶的表达。纤维素、麸皮等复合碳源条件下,嵌合转录因子过表达菌株的木质纤维素降解酶产量显著提升,其中CXC-S过表达菌株的滤纸酶活力能够达到2.8 U/ml,与野生型菌株比较增加了7.3 倍。4.XlnR同源蛋白AraR及PDE07172的生物学功能的探究对XlnR的同源蛋白AraR在草酸青霉中的调控功能进行了鉴定,发现AraR调控L-阿拉伯糖、D-木糖等戊糖的代谢,同时对水解半纤维素侧链的阿拉伯呋喃糖苷酶的表达也起到显著激活作用。另外,发现AraR对XlnR能够进行部分调控功能上的补偿。当XlnR缺失时,AraR的表达量上调,承担起对木糖代谢过程中相关酶表达的调控。通过分析△PDE07172菌株对多种碳源的利用,并未找到PDE07172调控的具体生物学过程,该蛋白的功能有待进一步的深入研究。