白色念珠菌(Canidida albicans)是人类口腔的常驻微生物群的组分之一及最常见的机会条件致病真菌,当宿主机体免疫力降低时可引起体表以及深部组织器官的内源性感染。白色念珠菌同时也是医院获得性感染最常见的真菌病原体。白色念珠菌感染对于免疫力缺陷患者如艾滋病、癌症及器官移植等患者,后果尤为严重。虽然念珠菌感染发病率在各个国家地区有所不同,但来自美国、欧洲、拉美国家及亚洲等地的流行病学资料均显示念珠菌感染率过去十年里显著增加。念珠菌感染经常难以治愈,有时甚至会危及生命,在免疫缺陷患者并发念珠菌感染而导致的死亡率高达40-70%,大多数患者死于继发性念珠菌感染,而非死于原发疾病。大量研究资料表明绝大多数慢性白色念珠菌感染与其在宿主体内形成的生物膜密切相关,生物膜的药物耐受则是导致感染治疗失败或预后差的主要原因。生物膜的药物耐受性的主要机制有生物膜内细胞生长缓慢及密度阈值感应现象、生物膜胞外聚合物的屏障作用、药物输出泵基因表达上调及应激反应等等。随着对生物膜耐药机制研究的不断深入,越来越多的证据表明生物膜的药物耐受现象是由多因素导致的,上述因素无法完全解释生物膜出现的药物耐受现象。2006年,Lafleur等人发现白色念珠菌生物膜中有极少数细胞可以耐受致死剂量的抗真菌药物而不被杀灭。这部分幸存细胞被称为滞留菌细胞。收集幸存的滞留菌细胞再培养后,药敏实验显示其最低抑菌浓度(MIC)值并没有增高；并可以形成新的生物膜,再次接受高浓度抗真菌药物冲击后,绝大多数细胞仍然被杀灭,仅有与原始菌株相似水平的极少数滞留菌细胞幸存。与细菌滞留菌相似,白色念珠菌滞留菌是具有多药耐药性,不具备遗传特性的表型变异细胞,被认为是生物膜耐药的主要原因。2009年,Lafleur等人在对从46位长期接受化疗的癌症患者口腔中检测分离出的150株白色念珠菌临床菌株进行实验时发现,临床菌株产生滞留菌的水平与其在患者口腔内持续的时间有关。产生高比例滞留菌的临床分离株来自每一个连续8周以上的白色念珠菌携带患者。这一结果与K.Lewis教授实验小组的研究结果类似,他们通过持续监测一个囊性纤维化病人铜绿假单胞菌产生滞留菌能力,发现随着病程的延长,检出的菌株产生滞留菌的能力逐渐增强,晚期检出的菌株产生的滞留菌的比例较早期检出的菌株高达100倍以上。这些发现直接将致病微生物产生滞留菌能力与临床事实联系了起来,提示滞留菌与临床感染密切相关,很可能是临床上导致抗菌药物治疗失败,感染症状迁延不愈及反复发作的主要原因。此外,我们研究小组用两性霉素B治疗分别被产生高、低比例滞留菌的白色念珠菌临床菌株感染的秀丽隐杆线虫,结果发现感染高比例滞留菌菌株的线虫生存率明显低于感染低比例滞留菌菌株的线虫。这一发现再次证实了白色念珠菌生物膜中少数耐药滞留菌是临床上慢性白色念珠菌感染药物治疗失败及症状反复迁延不愈的主要原因。白色念珠菌滞留菌是生物膜中的一小部分处于休眠状态,不生长的,具有多药耐药性,不具备遗传特性的表型变异型微生物亚群,被认为是复发性慢性念珠菌感染的主要原因。然而白色念珠菌滞留菌的形成机制目前尚不明确,对于临床治疗造成很大困难。白色念珠菌滞留菌不同于细菌滞留菌,迄今仅在生物膜中检出,但是生物膜如何触发诱导滞留菌形成仍然不清楚。2006年,Lafleur等发现一些无法形成正常生物膜而仅能形成单层稀疏的孢子相生物膜的变异菌株同样也可以形成野生菌株水平的滞留菌。这一发现提示念珠菌滞留菌的形成可能是与粘附有关,并不依赖于生物膜复杂的空间立体结构的形成。然而,之前有关念珠菌滞留菌的研究均是集中于48 h成熟生物膜中滞留菌的形成,缺乏对于早期生物膜中滞留菌形成的研究,需要进一步研究。此外,由于白色念珠菌滞留菌在生物膜中所占的比例很小,以及其瞬时可逆性表型特征,导致分离收集滞留菌进行研究十分困难。滞留菌被认为是不生长繁殖的、处于休眠状态的表型变异细胞。而这种休眠细胞的特征被认为是静止的代谢活动,如核酸合成和蛋白质合成。这也解释了抗真菌药物无法清除滞留菌的原因,因为药物作用的发挥需要与活跃的特异性作用靶点结合。2013年Kwan等发现通过相应的抗生素药物抑制转录、翻译过程及三磷酸腺苷ATP的形成,可以极大地增加大肠埃希杆菌滞留菌的形成。这一发现表明抑制合成代谢似乎是细菌滞留菌形成的主要机制,并且为分离研究滞留菌提供了可能。据此,我们推测抑制核酸和蛋白的合成可能促进白色念珠菌滞留菌的形成。目的1.拟动态监测白色念珠菌滞留菌在生物膜形成过程中,尤其是在粘附阶段中的形成情况,以进一步阐释滞留菌形成与早期生物膜,尤其是粘附阶段可能的关系。2.在本实验中,我们试图通过5-氟胞嘧啶预处理诱导白色念珠菌细胞进入“休眠”状态,检测休眠是否可以促进滞留菌的形成,以期为分离研究滞留菌提供理论基础。3. 以粘附阶段的早期生物膜为研究对象,通过对生物膜细胞群进行转录组测序技术分析基因表达变化,初步筛选出与滞留菌形成相关的可疑基因,从而为进一步探索白色念珠菌滞留菌形成相关信号传导途径的具体机制提供基础,以期为研究新型抗真菌药物提供新的靶点,为临床治疗顽固性复发性念珠菌感染、清除滞留菌提供新的思路。方法1. 白色念珠菌滞留菌是在用高浓度两性霉素B及氯己定冲击白色念珠菌生物膜后出现两段式杀灭曲线时首次被发现的。自滞留菌被发现证实后,剂量依赖性杀灭曲线一直是滞留菌分离研究的唯一直接有效的方法。本实验中我们采用了类似的方法通过两性霉素B (100 μg/ml)来确定白色念珠菌滞留菌,共有3株白色念珠菌菌株用于检测滞留菌的形成。首先用白色念珠菌株CAI-4预先覆盖96-孔细胞培养板的表面,并在显微镜下观察确认附着表面已被完全覆盖。我们通过诱导测试白色念珠菌菌株在是否与附着表面直接粘附的情况下形成早期生物膜,并动态监测在生物膜形成过程中滞留菌的产生。滞留菌的确定基于两性霉素B作用后对细胞活力的评估。此外,我们还在加入两性霉素B处理生物膜的同时通过刮擦破坏附着的情况下,检测了生物膜中滞留菌细胞水平。2.5-氟胞嘧啶是目前临床上应用的唯一具有抑制核酸和蛋白合成的抗真菌药物。本实验中,我们试图用5-氟胞嘧啶诱导白色念珠菌细胞进入休眠来增加滞留菌的形成,共有8株白色念珠菌菌株用于实验。白色念珠菌细胞被5-氟胞嘧啶(浮游细胞：0.8生物膜细胞：1μg/ml)在37℃预处理6 h。通过对5-氟胞嘧啶预处理期间白色念珠菌细胞内的核酸水平的检测来验证细胞是否被成功诱导进入休眠状态。经5-氟胞嘧啶预处理后的白色念珠菌生物膜及浮游相培养物经两性霉素B作用后通过平板菌落计数来确认滞留菌形成的情况。3.收集不同时间点的早期生物膜细胞(0,0.5,1,1.5,2,4h),进行基因转录组测序分析。测序数据经过质控分析合格后,则进行后续分析,包括基因表达、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNP检测等一系列后续分析,并从基因表达结果中,筛选出样品间差异表达的基因。结合在生物膜形成早期阶段(0-2 h)滞留菌水平的动态监测结果,初步筛选出与白色念珠菌耐药滞留菌形成相关的可疑基因。然后进一步对初步筛选的可疑基因进行GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析。结果1.一旦白色念珠菌细胞附着到表面,即可检出滞留菌,其比例大约在2h生物膜中达到峰值。随着生物膜的成熟,滞留菌的比例不断下降,在24 h成熟生物膜中仅占0.01-0.02%,滞留菌数量自2h后保持稳定没有明显改变。在形成于被其他菌株预先覆盖表面的生物膜中,及在接受两性霉素B治疗同时被破坏表面附着的生物膜中,均未检出滞留菌细胞。2.5-氟胞嘧啶预处理成功地诱导白色念珠菌细胞进入休眠状态。然而,在接受5-氟胞嘧啶预处理的浮游培养物,与未接受预处理的对照浮游培养物类似,未检测到滞留菌的形成。在所有测试菌株的生物膜中均检测到滞留菌,但是在经5-氟胞嘧啶预处理的生物膜中滞留菌的形成均未显著增加,不具有统计学意义。3. 基因转录组分析发现,在白色念珠菌与附着表面接触30min内即可发现基因表达方面的差异。结合白色念珠菌滞留菌水平在早期阶段生物膜(0-2 h)中的变化趋势,共有228个基因被初步确认可能与白色念珠菌生物膜滞留菌形成相关。在生物膜形成早期阶段(0-2 h)中,基因表达变化趋势与白色念珠菌滞留菌形成变化趋势一致的基因约有97个,与白色念珠菌滞留菌在早期生物膜中形成变化趋势相反的基因约有131个。结论1.仅在白色念珠菌细胞与附着表面直接粘附而形成的生物膜中检出滞留菌,且主要产生于早期生物膜形成的粘附阶段。这一结果进一步证实表面粘附,而非生物膜结构的形成,是白色念珠菌滞留菌形成和维持所必需的。白色念珠菌细胞与附着表面的粘附可能先于生物膜形成触发了某未知细胞信号传导途径,导致少数细胞随机进入休眠状态,由常规细胞转变为滞留菌细胞,从而躲避了致死剂量的抗真菌药物的杀伤作用。2.抑制核酸合成并未显著增加白色念珠菌滞留菌的形成,提示休眠似乎并非是白色念珠菌滞留菌形成的机制。与细菌滞留菌相比,白色念珠菌滞留菌的形成似乎更加复杂。3.白色念珠菌生物膜耐药滞留菌的形成是随机性和确定性因素共同作用的结果。