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口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一种急性、烈性传染病,主要感染猪、牛、羊等偶蹄目动物。口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)是口蹄疫病原体,属小RNA病毒科,口疮病毒属,基因组为单股正链RNA。VPg由FMDV编码,是病毒RNA复制的引物,通过磷酸二酯键与 RNA 5’端连接。酪氨酰-DNA-磷酸二酯酶-2(Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase-2,TDP2)是一个多功能蛋白,研究发现TDP2具有VPg解连接酶活性,可以剪切小RNA病毒科病毒基因组RNA与VPg之间的磷酸二酯键。但目前尚未查阅到关于TDP2在FMDV增殖过程发挥作用的报道。本课题将在细胞水平分析TDP2对口蹄疫病毒增殖的影响,并解析其分子作用机理。首先,本研究通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,综合单细胞培养、基因组PCR、DNA测序和Western blot鉴定,成功构建了TDP2基因大片段删除的PK-15细胞系(PK-15TDP2-/-。在此基础上,分别测定 了一株 A 型(A/GDMM/CHA/2013)和一株 O 型(O/BY/CHA/2010)FMDV 的生长曲线。结果显示,与野生型PK-15细胞相比,A/GDMM/CHA/2013和O/BY/CHA/2010在PK-15TDP2-/-细胞中的增殖受到了显著的抑制;感染后8 h,两株FMDV在PK-15 TDP2-/-细胞中的病毒滴度约为野生型PK-15细胞中的二百分之一。TDP2补偿实验结果显示,在PK-15TDP2-/-细胞中表达TDP2蛋白可以部分恢复FMDV的增殖能力,说明TDP2蛋白参与FMDV的增殖。为了探究TD究P2基因敲除抑制FMDV增殖的机制,本研究对FMDV进入宿主细胞、病毒RNA复制和蛋白翻译、子代病毒从感染细胞中释放等感染过程进行了相关分析,发现在PK-15TDP2-/-内,由于FMDV在感染初期不能利用宿主TDP2,病毒基因组RNA的复制和蛋白翻译受到影响,进而不能在PK-15TDP2-/-细胞中大量增殖。同时,本研究构建了 TDP2过表达(PK-15TDP2-OE)和TDP2内质网表达(PK-15T-DP2-ER)的PK-15 细胞系,并测定了 PK-15TDP2-OE和PK-15TDP2-ER细胞系 A/GDMM/CHA/2013 和O/BY/CHA/2010毒株生长曲线。结果显示,FMDV在PK-15TDP2-OE细胞系中的增殖能力与在野生型PK-15细胞中相当,但是在PK-15TDP2-ER细胞中的增殖受到明显抑制。感染O/BY/CHA/2010后,PK-15TDP2-ER细胞系中病毒滴度呈先增后降趋势,但病毒滴度比相同时间点野生型PK-15细胞低10倍以上。进一步免疫荧光定位分析显示,TDP2在病毒增殖过程中与病毒复制复合体共定位。由此推测FMDV在PK-15TDP2-ER细胞中增殖受到抑制,可能是病毒在增殖后期不能有效躲避TDP2,病毒基因组被TDP2切割后不能包装成新病毒所致。然后,本研究利用高通量测序方法测定了野生型、TDP2过表达、TDP2内质网表达、TDP2基因大片段删除的PK-15细胞感染FMDV前后的mRNA表达情况,构建其基因表达图谱,并鉴定差异表达基因。结果显示,与感染O/BY/CHA/2010的野生型PK-15细胞相比,感染该毒株后的TDP2过表达,TDP2内质网表达和TDP2基因大片段删除细胞中分别有223、709和2375个基因的表达存在显著差异。显著差异表达基因的GO功能显著性富集分析和Pathway显著性分析显示,甾体类激素生物合成,细胞代谢和NF-κκB信号通路参与调控FMDV细胞水平增殖过程,PI3K AKT3,PCNA,IL6等基因在其中发挥了重要作用。最后,通过Pull Down实验,在PK-15细胞和感染O/BY/CHA/2010毒株的PK-15细胞中分别鉴定了 20个和13个TDP2的结合蛋白。分析发现,这些蛋白主要参与金属离子结合,RNA结合,组蛋白和细胞骨架组成等生命活动,暗示TDP2可能通过多种途径影响FMDV细胞内增殖。综上所述,本研究发现TDP2在调控FMDV细胞水平增殖过程中发挥多种重要作用,建立了TDP2影响FMDV增殖的分子作用模型,构建了猪TDP2基因敲除、过表达和在内质网表达以及对照组PK-15细胞FMDV感染前后的转录组图谱,结合Pull Down实验鉴定出了多个参与TDP2调控FMDV增殖的基因和信号通路。上述研究结果为利用基因编辑技术改良猪抗口蹄疫的性状提供了理论基础。