抑郁症是一种常见的精神疾病,患者常表现为消极沉闷、思维迟缓、注意力分散、快感缺乏、无价值感及罪恶感、睡眠障碍等,严重者甚至会出现自杀的念头。抑郁症具有高发病率、高复发率、高致残/死亡率等特点,严重威胁着患者的生命健康。抑郁症及其治疗措施已成为研究热点。动物模型是研究抑郁症及其治疗措施的必要手段之一,近年来,越来越多的学者倾向于多种动物模型的联合使用来提高实验结果的可靠性和科学性。获得性无助模型是一种常用的动物抑郁模型,而其使用的实验仪器,存在实验指标采集不全面、不准确,或功能不完善、系统不稳定且价格高昂等不足。前期研究表明,DS-1226(人参皂苷水解产物的有效组分)对于慢性束缚大鼠具有显著的抗抑郁作用,但其抗抑郁作用及机制有待进一步明确。针对上述问题,本课题结合计算机、机械电子工程和实验动物行为学等学科研制获得性无助实时监测分析处理系统,采用该系统建立大鼠获得性无助模型,同时结合小鼠绝望模型、小鼠慢性睡眠干扰模型、小鼠慢性不可预测性应激模型系统地评价人参总皂苷水解产物DS-1226的抗抑郁作用;采用LC-MS/MS测定DS-1226对模型动物海马组织中神经递质含量的影响,采用ELISA法测定DS-1226对模型动物血清中HPA轴激素水平的影响。通过以上研究,为抑郁症及抗抑郁药物研究提供一套客观可靠的实验系统,并为抑郁症的防治提供一种高效低毒的中药新药。主要研究内容及结果如下:1实验系统研制1.1建立高智能化、客观规范的大鼠获得性无助实时监测分析处理系统。系统由上位机和下位机组成。下位机采用封闭式的穿梭箱内部设计,箱内装有光、声、电刺激源及红外灯照明,采用单片机(MCU)作为数据控制中心,分别实现光、声、电的通断控制,并采用红外摄像头实现对实验动物行为信息的观察和提取;上位机采用PC机作为数据分析服务器,采用Microsoft Visual C++6.0语言环境开发软件,同时提供了多种语言的接口,实现了程序控制、计算机视觉以及图像处理方面等许多通用算法。上位机与下位机之间采用CAN总线协议实现通信,最终研制出高智能化、客观规范的获得性无助实时检测分析处理系统。1.2验证大鼠获得性无助实时监测分析处理系统的可靠性和稳定性,同时对获得性无助实验进行方法学考察。系统评价指标经过人机相关性分析,结果表明该系统提取指标客观规范。基于获得性无助实验模型两种造模时长(造模1天,1次/天,30分钟/次;造模3天,1次/天,30分钟/次)的比较研究,以及两种阳性药(盐酸帕罗西汀,10 mg/kg;盐酸丙咪嗪,90mg/kg)对获得性无助实验的拮抗作用的比较研究,实验结果进一步表明该系统具有高稳定性和可靠性。同时实验结果提示造模3天是一种更为稳定和可靠的造模方法;盐酸帕罗西汀和盐酸丙咪嗪均对获得性无助模型具有拮抗作用,且二者无显著差异。2药效学研究2.1人参DS-1226对小鼠绝望模型的抗抑郁作用。采用悬尾实验(TST)、强迫游泳实验(FST)评价DS-1226的抗抑郁作用。实验结果显示,DS-1226低剂量组(20 mg/kg)可明显减少TST不动时间,DS-1226中剂量组(40mg/kg)和高剂量组(80mg/kg)均可显著减少TST不动时间;DS-1226中剂量组(40 mg/kg)可显著减少FST不动时间。实验结果提示DS-1226在小鼠绝望模型上具有显著的抗抑郁作用。2.2人参DS-1226对小鼠睡眠干扰模型(CSI)的抗抑郁作用。采用悬尾实验(TST)、强迫游泳实验(FST)评价DS-1226对CSI模型的抗抑郁作用。实验结果显示,DS-1226低剂量组(20 mg/kg)TST和FST不动时间均有减少趋势;DS-1226中剂量组(40 mg/kg)TST不动时间显著减少,FST不动时间有减少趋势;DS-1226高剂量组(80 mg/kg)可显著减少TST和FST不动时间。实验结果提示DS-1226在小鼠CSI模型上具有显著的抗抑郁作用。2.3人参DS-1226对小鼠慢性不可预测性温和应激模型(CUMS)的抗抑郁作用。采用体重监测、糖水偏爱实验(SPT)、新奇抑制摄食实验(NSFT)、悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)评价DS-1226对CUMS模型的抗抑郁作用。实验结果表明,DS-1226各剂量组(20,40,80 mg/kg)在SPT和NSFT中均表现出显著的抗抑郁作用;DS-1226高剂量组(80 mg/kg)可明显逆转模型体重的下降;DS-1226低剂量组(20 mg/kg)和高剂量组(80 mg/kg)在TST中表现出显著的抗抑郁作用;而DS-1226中剂量组(40 mg/kg)则在FST中表现出显著的抗抑郁作用。以上实验结果表明,DS-1226在CUMS模型上具有显著的抗抑郁作用,其中高剂量组表现更为明显。但DS-1226抗抑郁活性的量效关系有待进一步探讨。2.4人参DS-1226对大鼠获得性无助模型(LH)的抗抑郁作用。采用大鼠获得性无助实时监测分析处理系统进行大鼠LH实验,同时采用大鼠强迫游泳实验评价DS-1226对LH模型的抗抑郁作用。在LH实验中,DS-1226各剂量组抗抑郁药效随给药时间增加。检测第3天时,DS-1226各剂量组(20,40,80 mg/kg)均可显著减少逃避失败次数、逃避潜伏期和潜伏期,显著增加被动回避次数,DS-1226低剂量组(20 mg/kg)可显著增加运动路程;在强迫游泳实验中,DS-1226低剂量组(20 mg/kg)和中剂量组(40mg/kg)可显著减少不动时间,DS-1226高剂量组(80mg/kg)不动时间明显减少。以上实验结果表明,DS-1226在大鼠LH模型上表现出显著的抗抑郁作用,并且抗抑郁作用优于阳性药帕罗西汀。3机制探讨3.1人参DS-1226对抑郁症模型神经递质的影响采用LC-MS/MS法测定CSI和CUMS模型动物海马组织中单胺类神经递质:5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)、高香草醛酸(HVA)、二羟苯乙酸(DOPAC)的水平;以及检测氨基酸类神经递质:γ-氨基丁酸(GABA)和乙酰胆碱(Ach)的水平。3.1.1人参DS-1226对慢性睡眠干扰模型(CSI)动物海马中神经递质的影响实验结果表明,与空白对照组比较,CSI模型动物海马中5-HT、NE、E、DA、DOPAC及GABA含量显著降低,表明CSI致小鼠抑郁样行为的产生可能与CSI引起海马中神经递质含量下降有关;DS-1226可显著提高CSI模型动物海马5-HT、NE、E、DOPAC、HVA及GABA和Ach水平,提示增加海马中5-HT、NE、E及GABA等神经递质的释放可能是DS-1226抗抑郁作用的重要机制。3.1.2人参DS-1226对慢性不可预测性温和应激模型动物(CUMS)海马中神经递质的影响实验结果表明,与空白对照组比较,CUMS模型动物海马中5-HT、NE、DA及GABA和Ach含量显著降低,表明其与空白组比较处于抑郁状态;DS-1226可显著提高CUMS模型动物海马中5-HT、5-HTAA、NE、DA、HVA及GABA水平,提示增加海马中5-HT、NE、DA及GABA等神经递质的释放可能是DS-1226抗抑郁作用的重要机制。3.2人参DS-1226对抑郁症模型下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的影响采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定CSI和CUMS模型动物血清中HPA轴中促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)的水平。3.2.1人参DS-1226对慢性睡眠干扰模型(CSI)动物HPA轴的影响实验结果表明,与空白对照组相比,CSI模型组小鼠血清中CRF、ACTH和CORT水平升高,表现出抑郁状态;DS-1226中剂量组(40mg/kg)和高剂量组(80mg/kg)可显著降低CSI模型小鼠血清中的CRF、ACTH和CORT水平,提示DS-1226可能是通过调节HPA轴对CSI模型动物产生抗抑郁作用。3.2.2人参DS-1226对慢性不可预测性温和应激模型(CUMS)动物HPA轴的影响实验结果表明,与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠血清中CRF、ACTH和CORT水平升高,表现出抑郁状态;DS-1226各剂量组(20,40,80 mg/kg)均可显著逆转CUMS模型小鼠血清CRF、ACTH和CORT水平升高,提示DS-1226可能是通过调节HPA轴对CUMS模型动物产生抗抑郁作用。4结论本课题通过结合计算机、机械电子工程和实验动物行为学,研制出高智能化的大鼠获得性无助实时检测分析处理系统;通过指标验证、造模时长比较实验以及阳性药比较实验不仅验证大鼠获得性无助实时监测分析处理系统具有可靠性高、客观规范性好和稳定性佳的优点,同时也对获得性无助实验进行了方法学考察。采用TST、FST、CSI、CUMS、LH实验进一步证实DS-1226具有显著的抗抑郁作用;采用LC-MS/MS法测定CSI和CUMS模型动物海马中神经递质的水平,采用酶联ELISA法测定CSI和CUMS模型动物血清中HPA轴各激素水平,根据结果推测DS-1226的抗抑郁作用机制与促进神经递质释放和缓解HPA轴功能亢进有关。通过本课题,研制出高智能化获得性无助实时检测分析处理系统,为抑郁症和抗抑郁药物研究提供一套必要的工具。与此同时,明确了 DS-1226的抗抑郁作用及其可能的作用机制,为DS-1226抗抑郁功效研究提供了充分的实验和理论依据。