类球红细菌GY-2遗传操作体系的开发

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辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂,广泛应用于医药、食品、工业等领域。类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)是生物发酵法生产辅酶Q10的高产菌株,目前对它的研究主要集中在发酵条件优化、诱变育种等方面。随着类球红细菌辅酶Q10合成途径的深入研究,开发一套可反复使用的类球红细菌遗传操作体系,对利用代谢工程优化类球红细菌辅酶Q10合成十分重要。本研究首先利用宽宿主质粒pBBR1MCS-2,将辅酶Q10合成途径中的关键基因ddsa在类球红细菌R.sphaeroides GY-2中进行了过表达,但Q10产量却下降,这主要是由于外源质粒引起的生长负担所致。因此,本研究进一步开发并完善了一套适合在类球红细菌中整合的宽宿主温度敏感型质粒pBBR1MCS-2M。对该质粒的丢失率、REP蛋白的二级结构以及拷贝数变化的研究表明,rep基因第73位置碱基A突变成G,引起第25位Lys向Glu的突变,从而导致该质粒对温度敏感;在宿主E.coil T1中,42℃条件下该质粒的丢失率接近100%,在宿主宿主R.sphaeroides GY-2中,37℃条件下该质粒的丢失率约为50%;圆二色谱表明突变蛋白二级结构发生了明显的变化,其Tm值降低了 4.2℃;在E.coil T1中,42℃和30℃培养条件下温敏质粒pBBR1MCS-2M的拷贝数均明显低于出发质粒pBBR1MCS-2的拷贝数,且这两种培养温度下,温敏质粒和出发质粒的拷贝数均明显下降,表明温敏质粒构建成功,但在类球红细菌中,在30℃和37℃培养条件下,温敏质粒和出发质粒的拷贝数都升高,这可能是质粒发生了随机整合。Upp是编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶(URTP)的基因,常用于基因的无痕敲除与置换。本研究进一步利用所改造的温敏质粒pBBR1MCS-2M,成功地无痕敲除了类球红细菌R.sphaeroidesGY-2的upp基因,获得R.Sphaeroides GY-2 △up的突变菌株,同时构建upp基因互补型的质粒(pBBR1MCS2-tac-upp),将其导入到R.Sphaeroides GY-2 △p中。生长曲线结果表明,突变菌株R.Sphaeroides GY-2 △p和野生菌R.Sphaeroides GY-2有相似的生长曲线。5-FU敏感性实验和卡那霉素(Kan)抗性实验结果表明,突变菌株R.Sphaeroides GY-2 △upp能在含7 μM的5-FU(5-氟尿嘧啶)sistrom’s的培养基中生长且不能在含Kan抗性的平板生长,说明在37℃高温条件下类球红细菌中的温敏质粒pBBR1MCS-2M可以被完全消除。而R.Sphaeroides GY-2和在缺失upp基因的类球红细菌中转入含有表达upp基因的质粒(pBBR1MCS2-tac-upp)均无法在2μM的5-FU sistrom’s的培养基中生长。因此,该系统可用于反复改造类球红细菌遗传操作体系。
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