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目的1、通过检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)及骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4)在直肠末端肠壁的表达情况,研究不同类型先天性肛门直肠畸形(anorectal malformation, ARM)胎鼠肠神经系统(enteric nervous system,ENS)的发育程度,探讨ARM患儿术后排便功能障碍的机制。2、通过检测Shh/BMP4信号在直肠末端的表达水平,探索正常及AFM胎鼠ENS发育过程中可能涉及的分子调控机制。方法1、ARM动物模型建立：将实验动物随机分为实验组和对照组,应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)致畸,建立ARM胎鼠模型。在实验组孕鼠(n=10)妊娠第10天时,将ATRA以40mg/ml浓度溶于橄榄油后,按100mg/kg一次性大剂量灌胃；对照组孕鼠(n=6)给予等量橄榄油灌胃。2、NSE和BMP4的免疫组化染色：对照组和实验组孕鼠,于孕20天时行剖宫术,胎仔置于4%多聚甲醛中固定过夜,以正中矢状位劈开胎鼠,取其盆部常规酒精脱水,石蜡包埋,所得标本矢状位连续切片,厚度为4μm在显微镜下观察未染色的石蜡切片,根据直肠闭锁位置区分高低位,分别选取对照组、高位ARM组、低位ARM组胎鼠标本15例,取正中矢状位切片进行免疫组化染色。3、RT-POR实验：解剖显微镜下剖取直肠末端组织1cm置于液氮中暂存。分别检测12例高位AFM组、低位AFM组、对照组直肠末端Shh和BMP4基因的表达水平。结果1、免疫组化染色：对照组肠壁肌间及黏膜下神经丛可见NSE和BMP4抗体染色阳性细胞,ARM位组分别与ARM低位组、对照组比较,阳性细胞的平均光密度值(mean optical density,MOD)明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)；ARM低位组和对照组相比,阳性细胞的MOD值略降低,差异也有统计学意义(P<0.05)。2、半定量分析Shh、BMP4基因mPNA含量：在直肠末端Shh和BMP4基因表达呈显著正相关关系(P<0.01,r=0.884),对照组分别与高、低位ARM组相比较,BMP4和Shh基因的表达水平明显高于各组,差异均有统计学意义(P<0.05),不同畸形组之间比较,高位ARM组的表达水平显著减弱,低于低位ARM组,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论1、不同类型ARM胎鼠直肠末端BNS发育程度存在差异,不仅与闭锁的位置密切相关,还可能与BMP4基因的表达水平有关。2、Shh/BMP4表达下降,不仅与肛门直肠畸形的发生有关,还可能与肛门直肠畸形胎鼠直肠BNS发育不良有关。