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【目的】核糖核酸(RNA)N~6-甲基腺苷(N~6-methyladenosine,m~6A)修饰是一种动态可逆的过程,由甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase like protein 3,METTL3),甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase like protein 14,METTL14)和肾母细胞瘤1相关蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein,WTAP)等多个蛋白组成的复合物介导生成,去甲基酶Alk B同源物5(Alk B homolog 5,ALKBH5)或脂肪和肥胖相关蛋白(Fat-mass and obesity-associated protein,FTO)去除。在此种m~6A修饰模型中,METTL3是唯一发挥核心催化作用的蛋白质。蛋白质-蛋白质相互作用在细胞生命活动中具有重要意义,是细胞生化反应网络的主要组成部分,可与转录调控网络共同作用参与细胞生命活动调节。为探究宫颈癌细胞内m~6A甲基化过程中的调控机制,本文探寻了与METTL3存在相互作用的蛋白,并阐明了二者之间存在的调节作用或其他生物学功能。【方法】首先,通过Flag抗体亲和珠免疫共沉淀联合蛋白质谱分析筛选得到大量潜在的与METTL3存在相互作用的蛋白,再通过蛋白免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)技术和免疫荧光实验明确所选定的兴趣蛋白锌指蛋白91(zinc finger protein 91,ZFP91)或核不均一核糖核蛋白U(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U,HNRNPU)与METTL3存在相互作用且在细胞内有共定位。其次,分别探索ZFP91、HNRNPU与METTL3相互作用后可能的调节作用或其他生物学功能。蛋白免疫印迹(Western Blotting)实验检测ZFP91对METTL3蛋白表达的影响,放线菌酮(Cycloheximide,CHX)药物处理后检测ZFP91对METTL3半衰期影响。溶酶体抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)或蛋白酶体抑制剂MG132(Z-LLL-CHO,MG132)处理细胞研究METTL3降解的主要途径,泛素化实验检测ZFP91对METTL3泛素化水平的影响。实时荧光定量核酸扩增实验(Real-time quantitative PCR,q PCR)和Western Blotting分别检测HNRNPU对METTL3的RNA和蛋白表达的影响。RNA m~6A甲基化修饰特异检测试剂盒(Ambion,比色法)检测HNRNPU对METTL3甲基化功能的影响。甲基化RNA免疫沉淀(Methylated RNA immunoprecipitation,Me RIP)检测肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNFα)是否存在METTL3介导的m~6A甲基化修饰以及HNRNPU对TNFα的甲基化修饰是否存在调节作用。SRAMP网站预测TNFα甲基化修饰潜在修饰位点。【结果】Flag抗体亲和珠免疫共沉淀联合蛋白质谱分技术筛选得到约250个可能与METTL3相互作用的蛋白质,查询蛋白相关资料并结合本课题的研究背景,选择ZFP91和HNRNPU作为兴趣蛋白进行探索研究。Co-IP实验结果显示不论是ZFP91还是HNRNPU均与METTL3存在相互作用。免疫荧光共聚焦结果也表明ZFP91、HNRNPU与METTL3均存在共定位,且共定位于细胞核。进一步探索后发现ZFP91能降低METTL3蛋白表达水平。CHX处理条件下,ZFP91缩短了METTL3蛋白半衰期,影响了蛋白的稳定性。CQ与MG132分别处理He La细胞,收取蛋白样品后进行Western Blotting实验,结果显示ZFP91促进METTL3降解主要是通过蛋白酶体途径,而泛素化实验则表明ZFP91能促进METTL3的泛素化修饰,所以ZFP91是通过促进METTL3蛋白的泛素化水平缩短蛋白半衰期进而加速降解。HNRNPU与METTL3相关实验结果显示,HNRNPU不仅对METTL3的m RNA水平以及蛋白水平表达无影响,而且对METTL3的m~6A甲基转移酶活性功能也无调控作用。TNFα存在由METTL3介导的m~6A甲基化修饰,且HNRNPU促进TNFα甲基化修饰。【结论】本研究表明ZFP91作为非典型的E3泛素连接酶能通过促进METTL3的泛素化水平降低METTL3蛋白稳定性;HNRNPU能促进METTL3对TNFα的m~6A甲基化修饰,增强其基因表达。