金鱼草中R2R3-MYB基因AmMYB308L的克隆及其功能研究

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植物的次生代谢产物是植物在长期进化中,与环境相互作用而产生的必然结果,广泛参与植物生长、发育和防御等生理过程,也是天然药物和工业原料的重要来源。目前金鱼草次生代谢途径已经清晰,但是分子调控机制仍然不够了解。本课题以模式植物金鱼草为材料,克隆了参与调控植物次生代谢途径的R2R3-MYB转录因子AmMYB308L并对其分子调控机制进行了深入研究。  R2R3-MYB转录因子是调控植物次生代谢途径的最重要的转录因子,通过R2R3-MYB保守域引物,克隆到了29个含有R2R3-MYB保守域的基因片段。通过构建系统发育树选择了可能参与调控苯丙氨酸代谢途径基因片段并进行全长克隆,获得723bp的AmMYB308L基因,构建了该基因的过表达载体pJAM1502-AmMYB308L和RNAi载体pH7GWIWG-ammyb308l。通过农杆菌介导法将该基因成功转化金鱼草和毛地黄。我们发现AmMYB308L的过表达引起了金鱼草毛状根加速老化、毛地黄叶片出现褐色斑点并过早死亡的现象。通过对参与植物次生代谢途径的合成酶基因进行RT-PCR分析,我们发现AmMYB308L的过表达引起C4H、4CL和CAD的表达量下调,而这三个基因是木质素生物合成途径的重要基因。同时对木质素的间苯三酚染色实验,发现在过表达AmMYB308L金鱼草的毛状根的木质素染色相比负对照着色较浅甚至没有着色,推测该基因可能抑制植物木质素的生物合成。  为了进一步证明AmMYB308L参与调控植物的次生代谢途径,对AmMYB308L植物的可溶性酚类进行HPLC检测。HPLC结果显示木质素合成途径的重要酚酸咖啡酸、阿魏酸和香豆酸的含量下降明显。这说明AmMYB308L抑制了木质素代谢途径中酚酸类的生物合成。另外,发现AmMYB308L植物的绿原酸的含量相比野生型下降显著,而绿原酸是影响植物呼吸作用的重要可溶性酚酸,这就可以解释过表达AmMYB308L植物的根和叶片出现过早死亡的现象。  木质素是构成细胞壁的高聚物,为了定量分析植物木质素的组成和含量变化,对植物细胞壁进行硝基苯氧化,将木质素降解成基本的结构单元。通过HPLC检测木质素结构单元的含量,发现AmMYB308L植物的木质素含量相比负对照下降47.3%。同时在木质素含量较高的老化的根中,G/S百分比减少了19%。这说明AmMYB308L不但抑制木质素含量,而且改变了木质素的组成结构。  以上实验结果表明,AmMYB308L参与调控植物次生代谢途径,抑制了次生代谢途径重要可溶性酚酸的代谢,影响了木质素的组成和含量,而木质素的组成对于制浆、造纸漂白等工艺以及木质素的综合利用都具有指导意义。另外,本研究建立稳定高效毛地黄的再生和遗传转化体系,该体系可用于次生代谢途径的分子调控机制的研究,同时可以用反向遗传学的方法实现人为地改变次生代谢产物如洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷原和地高辛的含量,具有重要的药用和经济价值。
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