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目的:1研究MiCroRNA-23a在胰腺癌组织中的表达情况及其与临床病理资料的关系。2研究MiCroRNA-23a在不同胰腺癌细胞株(Aspc-1,Bxpc-3,Cfpac-1,Panc-1)的表达规律。3研究MiCroRNA-23a体内体外促进胰腺癌细胞侵袭转移。4研究MiCroRNA-23a通过靶向抑制上皮剪接调节蛋白1(epithelial splicing regulator protein 1,ESRP1)改变CD44亚型表达,促进胰腺癌细胞发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT),促进胰腺癌细胞侵袭转移。方法:1.收集西南医院肝胆外科2013年1月~2013年12月手术切除的胰腺癌标本及患者临床病理资料共计47例,记录患者FOS及OS。采用RT-PCR方法检测MiCro RNA-23a在胰腺癌原发灶,转移淋巴结组织以及癌旁正常胰腺组织中的表达情况,比较MiCroRNA-23a在上述三种组织中的表达差异。计算癌组织中MiCro RNA-23a的相对平均表达量,并根据该值将所有标本分为MiCroRNA-23a高表达组和低表达组,分析MiCroRNA-23a表达与临床病理资料的关系。采用Kaplan-Meier软件进行生存分析,研究不同表达水平的MiCro RNA-23a对胰腺癌患者预后的影响。2.qRT-PCR和Western blot检测EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cad),N-钙黏蛋白(N-cad),波形蛋白(VIM)的表达,观察细胞形态,TGF-β1诱导EMT处理,区分胰腺癌细胞系Aspc-1,Bxpc-3,Cfpac-1,Panc-1的上皮、间质表型。qRT-PCR检测正常胰腺导管上皮细胞(PDC)和胰腺癌细胞(Aspc-1,Aspc-1+TGF-β1,Bxpc-3,Bxpc-3+TGF-β1,Cfpac-1,Panc-1)mi RNA-23a的表达,观察其表达与胰腺癌细胞EMT表型的关系。干扰mi R-23a,观察对TGF-β1诱导EMT的影响。3.miR-23a mimic和mi R-23a inhibitor分别转染Aspc-1和Panc-1,观察其侵袭迁移能力的变化;构建mi R-23a sponges慢病毒表达载体,转染Panc-1细胞,建立稳定细胞株,裸鼠体内实验观察mi R-23a促进胰腺癌转移。4.基因芯片分析和生物信息学网站(TargetScan.com)搜索结果交叉比较,双荧光素酶报告质粒实验验证ESRP1是mi R-23a的直接靶基因。5.研究干扰miR-23a对ESRP1表达的影响,qRT-PCR检测胰腺癌组织ESRP1的表达,与miR-23a的表达进行相关性分析;干扰或过表达ESRP1,观察对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响;ESRP1回复实验,观察对mi R-23a影响胰腺癌细胞EMT的逆转作用。6.Western blot、qRT-PCR分别检测mi R-23a对ESRP1及其下游CD44s/CD44v、FGFR2 IIIb/IIIc剪接亚型表达的影响。ESRP1回复实验观察干扰mi R-23a表达对下游剪接分子表达的影响。结果:1.胰腺癌转移淋巴结组织中mi R-23a的表达显著高于胰腺癌原发灶和癌旁正常组织,胰腺癌MiCroRNA-23a表达与肿瘤组织分化程度、肿瘤浸润深度(T分期)以及胰腺癌淋巴结转移(N分期)具有显著相关性,而其表达与年龄、性别,肿瘤发生部位及远处转移(M分期)等无相关性。生存分析发现,MiCroRNA-23a表达与胰腺癌肿瘤患者预后具有相关性,高表达组预后差,生存期均低于低表达组,两者相比较差异具有统计学意义。2.1 Aspc-1、Bxpc-3细胞呈上皮表型,Cfpac-1、Panc-1为间质表型,TGF-β1诱导Aspc-1、Bxpc-3后,发生EMT。miR-23a在间质表型的胰腺癌细胞中表达明显增高。结合mi R-23a在胰腺癌转移淋巴结组织中表达增高,推测miR-23a可能促进胰腺癌细胞上皮间质转化及侵袭转移。干扰mi R-23a,抑制了TGF-β1诱导上皮表型胰腺癌细胞EMT的发生。3.体外实验证明,mi R-23a mimic转染Aspc-1导致其侵袭迁移能力增强,mi R-23a inhibitor转染Panc-1导致其侵袭迁移能力减弱;体内实验证明,mi R-23a sponges慢病毒表达载体转染Panc-1细胞,可以抑制miR-23a的功能,从而抑制胰腺癌细胞生长及转移。4.基因芯片分析及生物信息学检索,证实ESRP1是miR-23a的直接的下游靶基因,荧光素酶报告质粒实验证实ESRP1是mi R-23a的直接靶基因。5.ESRP1维持胰腺癌细胞的上皮表型,干扰mi R-23a,ESRP1的表达发生变化;胰腺癌组织中,ESRP1的表达与miR-23a的表达呈显著负相关。ESRP1si RNA转染Aspc-1后导致其侵袭迁移能力增强;ESRP1过表达质粒转染Panc-1后导致其侵袭迁移能力减弱。ESRP1回复实验,可以部分逆转干扰mi R-23a表达后对胰腺癌细胞EMT的影响。6.qRT-PCR、WB检测证实mi R-23a靶向抑制ESRP1的表达,从而导致下游剪接分子CD44s/CD44v、FGFR2 IIIb/IIIc的表达变化,ESRP1回复实验可以部分逆转干扰mi R-23a表达对下游剪接分子表达的影响。结论:1.MiCroRNA-23a在胰腺癌淋巴结转移灶中的表达明显高于胰腺癌原发灶及癌旁正常胰腺组织,MiCroRNA-23a表达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度以及胰腺癌淋巴结转移呈显著正相关,MiCroRNA-23a表达与胰腺癌预后具有显著相关性。2.上皮表型胰腺癌细胞低表达MiCro RNA-23a,间皮表型胰腺癌细胞高表达MiCroRNA-23a,当上皮表型的胰腺癌细胞发生EMT时,MiCroRNA-23a的表达显著增高,因此MiCroRNA-23a可能促进了胰腺癌细胞EMT。3.过表达MiCroRNA-23a能够促进胰腺癌细胞由上皮表型向间质表型转化;抑制MiCroRNA-23a表达能够促进胰腺癌细胞由间质表型向上皮表型转化。4.MiCroRNA-23a能够增强胰腺癌细胞体外培养细胞以及裸鼠体内的侵袭转移能力。5.MiCroRNA-23a通过靶向抑制ESRP1的表达对胰腺癌细胞上皮间质转化发挥调控作用,从而促进胰腺癌细胞侵袭转移。6.ESRP1通过调控CD44s/CD44v选择性剪接以及FGFR2IIIb/IIIc分子的表达变化影响胰腺癌细胞上皮间质转化。