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目的:本研究旨在研究瘦素(Leptin)对体外培养的SD大鼠脂肪来源干细胞(SD rat adipose-derived stem cells,ADSCs)的增殖及由转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1)诱导ADSCs向软骨细胞(Chondrocytes,CHOs)转化过程中的影响,探讨瘦素对增殖及诱导转化过程是否具有一定的促进作用。 方法:1、SD大鼠脂肪来源干细胞的获取及培养:清洁级雄性SD大鼠30只(体质量200 g左右),无菌下取腹股沟、睾丸脂肪垫脂肪组织,经分离、消化、离心后种瓶培养 SD大鼠脂肪间充质干细胞,定期给予换液及传代。通过倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照,根据 MTT测定的吸光度值绘制 SD大鼠脂肪来源间充质干细胞P1(第1代)、P3(第3代)、P5(第5代)、P9(第9代)各代的细胞生长曲线。根据各代细胞对数生长期获得的吸光度值以及其倍增时间按公式测算各代倍增时间。2.P3 SD大鼠脂肪来源的间充质干细胞被分为4组:空白组:G0组(完全培养基);对照组:G1组(诱导培养基、瘦素),G2组(诱导培养基、TGF-β1);实验组:G3组(诱导培养基、TGF-β1、瘦素)。诱导培养基定期换液,细胞形态学观察倒置相差显微镜拍摄。根据 MTT法测定各组细胞进入对数生长期早期72h、96h、120h吸光度值,绘制各组细胞的增殖曲线。甲苯胺蓝染色法鉴定诱导14d后的ADSCs中软骨基质的表达。Realtime PCR方法对G2、G3组细胞中Ⅱ型胶原蛋白及 TGF-β1的mRNA半定量比较。采用方差分析进行组间均数比较,以P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:1、通过对 ADSCs分离提取,在适宜的体外环境培养后,定期显微镜下观察细胞形态得到结果:原代细胞培养24h后即可见细胞贴壁;培养7d细胞扩散增长,成纤维细胞的生长和螺旋生长。传代后细胞贴壁及增殖速度明显加快。2、根据MTT法绘制生长曲线:从各代细胞生长曲线情况可得出,接种后ADSCs在1~3d处于生长停滞期,各代 ADSCs均在在3d进入对数生长期,第1、3代在6~7d进入平台期,倍增时间为(47±3)h;第5、9代在5~6d进入平台期,倍增时间为(49±3)h。3、根据 MTT法比较组间增殖情况:在进入对数生长期早期72h,G0组与G1组,G3组与G2组比较SD大鼠ADSCs吸光度值的差异不具有统计学意义(P>0.05);在进入对数生长期早期120h G0组与G1组之间SD大鼠ADSCs吸光度值的差异不存在统计学意义(P>0.05),G2组与 G3组之间SD大鼠ADSCs吸光度值的差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。4.甲苯胺蓝染色结果:ADSCs经诱导分化至第14 d后,行甲苯胺蓝染色检测,G2、G3组呈现出软骨基质的表型特征。5. Realtime PCR结果:Ⅱ型胶原 mRNA表达的2(-ΔΔCt)值:设 G2组1.000±0.000,G3组1.613±0.197,结果显示 G3组Ⅱ型胶原 mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1mRNA表达的2(-ΔΔCt)值:设 G2组1.000±0.000,G3组1.291±0.203,结果显示 G3组 TGF-β1 mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:瘦素在促进 ADSCs增殖作用是通过 TGF-β1的间接作用;在诱导 ADSCs向软骨分化过程中,瘦素具有显著加强诱导转化作用,推测瘦素通过提高 TGF-β1表达作用来实现促进诱导作用。