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本博士学位论文以河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)的血淋巴细胞(hemocytes)为材料,研究了亚慢性镉染毒对血淋巴细胞的毒性作用及免疫增强剂脂多糖的调节作用。实验设置了3个镉处理组(0.725、1.450和2.900 mg/L)和一个空白对照组,分别处理7 d、14 d和21 d。染毒后将蟹体平均分为两组,其中一组个体用来研究镉的毒性作用,另一组个体分别注射10μg/mL浓度的脂多糖用来研究脂多糖对镉毒性的调节作用。首先,采用透射电镜技术(transmission electron microscope,TEM)观察了血淋巴细胞的形态结构变化及膜的完整性,从形态学角度探究镉对血淋巴细胞超微结构的损伤。其次,用血球计数板统计了血淋巴细胞的总数(total hemocyte counts,THC);采用火焰原子吸收仪检测了血淋巴细胞中镉的富集量;用比色法测定了活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平,酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)和溶菌酶(lysozyme,LSZ)等溶酶体酶的活性;利用中性红染色法测定了溶酶体膜的稳定性,系统研究了由于镉的富集引起ROS水平升高而进一步介导的血淋巴细胞生理生化功能的变化,以及脂多糖对这种变化的调节作用。在此基础上,为了研究抗氧化酶活性和氧化损伤程度,用购置的生化试剂盒测定了总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、抗氧化酶:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性的变化及脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。此外,采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法测定了蛋白质羰基(protein carbonyl derivates,PCO)含量,用KCL-SDS沉淀法检测了DNA-蛋白质交联率(DNA-protein crosslink,DPC)。最后,利用实时荧光定量PCR法对免疫相关基因酚氧化酶原(prophenoloxidase,简称proPO)、溶菌酶(lysozyme,简称LSZ)和金属硫蛋白(metallothionein,简称MT)三种基因mRNA表达水平的变化,用比色法测定了PO的活性,从分子水平上研究了镉胁迫的应答机制及脂多糖的调节作用,阐述了镉对河南华溪蟹免疫系统的毒性作用及致毒机制。研究结果包括以下四个方面:1.镉对河南华溪蟹血淋巴细胞超微结构的影响根据细胞的整体形态、胞质中的颗粒数目及其大小可将河南华溪蟹血淋巴细胞分为三类:大颗粒细胞、小颗粒细胞和无颗粒细胞。其中大颗粒细胞的体积较大、细胞核较小、胞质中有较多的电子密度颗粒,而且各类细胞器较多;小颗粒细胞体积稍小,胞质中含少量颗粒;无颗粒细胞体积一般较小,几乎无颗粒,较少观察到细胞器。镉暴露可以引起溪蟹颗粒细胞进行脱颗粒,细胞核变形、染色质浓缩,线粒体出现了嵴断裂、空泡化甚至消失的现象,粗面内质网的腔扩张、其上的核糖体脱落,溶酶体膜模糊甚至破裂。另外还发现,高浓度组(2.900 mg/L)镉暴露时间由7 d延长至21 d时,血淋巴细胞超微结构的损伤程度较低浓度组(0.725 mg/L)的严重。2.镉处理对河南华溪蟹血淋巴细胞免疫相关因子的影响及脂多糖的调节作用河南华溪蟹血淋巴细胞镉的富集量随着染毒浓度的增加和暴露时间的延长,呈现上升趋势,并且有剂量-效应。镉导致溪蟹血淋巴细胞总数显著下降,ROS水平显著上升,溶酶体膜的稳定性下降。除LSZ外,镉暴露引起了血淋巴细胞中的ACP和AKP活性均升高;镉染毒后再注射脂多糖,与镉单独作用相比,脂多糖引起溪蟹血淋巴细胞总数下降,ROS在一定程度上降低,溶酶体膜的稳定性也下降,ACP和AKP活力均升高,LSZ活力无显著变化。3.镉胁迫对河南华溪蟹血淋巴细胞抗氧化酶和氧化损伤的影响及脂多糖的调节作用河南华溪蟹血淋巴细胞中抗氧化酶SOD、CAT、GPx和POD的活性随着镉浓度的增加和处理时间的延长而整体上呈现出“先升高后降低”的趋势,即低浓度镉(0.725 mg/L)显著诱导抗氧化酶活性升高,高浓度镉(2.900 mg/L)抑制了酶活性。脂多糖作用后,四种酶活性在不同程度上均低于其相应的镉处理组的活性。血淋巴细胞中的氧化损伤指标:PCO、DPC和MDA含量均呈现逐渐升高趋势。与镉单独作用相比,镉暴露后再注射脂多糖,三个氧化损伤指标出现不同程度的下降,然而镉暴露时间延长至21 d时,各氧化损伤指标无显著下降趋势,脂多糖在一定程度上减轻镉导致的氧化损伤效应。4.河南华溪蟹血淋巴细胞对镉的免疫应答及脂多糖的调节作用随着镉浓度的增加或者暴露时间的延长,河南华溪蟹血淋巴细胞中proPO mRNA的表达量在整体上呈现下降趋势,与镉单独作用相比,脂多糖作用后,proPO mRNA的表达量升高。PO活性在整个处理过程中呈现“先升后降”趋势。镉暴露后注射脂多糖,与相应的镉单独处理组相比,PO活性在整体上呈现下降趋势。镉诱导溪蟹血淋巴细胞中的LSZ mRNA表达水平均升高,并呈现出剂量-效应。镉暴露后注射脂多糖,与相应的镉单独处理组相比,LSZ mRNA表达水平出现不同程度的下降趋势。此外,随着暴露时间的延长或者镉浓度的增加,MT mRNA的表达水平有升高趋势,并呈现时间和剂量-效应。镉暴露后再注射脂多糖时,与相应的镉作用组相比,MT mRNA的表达水平呈下降趋势。研究结果表明:1.镉胁迫改变了河南华溪蟹血淋巴细胞的超微结构,其中高浓度镉暴露对血淋巴细胞造成的损伤更严重,说明血淋巴细胞是镉毒性作用的靶器官,这些结构上的损伤可能会影响免疫相关因子正常的合成和分泌,导致溪蟹失去正常的免疫功能。2.由于镉在河南华溪蟹血淋巴细胞的富集而引起了ROS水平的升高,而ROS进一步对溶酶体造成损坏,释放溶酶体酶;而脂多糖会降低ROS水平,在一定程度上能增强蟹体的免疫能力。3.镉可以通过改变河南华溪蟹血淋巴细胞抗氧化酶活性,进而诱导脂质、蛋白质和DNA发生氧化损伤,最终使血淋巴细胞免疫功能下降。脂多糖可以调节抗氧化酶活性,使氧化损伤指标降低。4.镉对河南华溪蟹血淋巴细胞免疫相关基因有明显的影响,镉抑制了proPO mRNA的表达,却能诱导LSZ和MT两种基因mRNA的表达,而脂多糖对这三种基因表达的调节作用不同。