论文部分内容阅读
剑尾鱼(Xiphophorus helleri)属鲻形目(Cyprinodontiformes)、花鳉科(Opecilidae)、剑尾鱼属(Xiphophorus)，是一种小型热带淡水鱼类。特点为体型小、繁殖周期短、繁殖力强、易饲养等，可在实验室条件下进行纯化培养。中国水产科学研究院珠江水产研究所早在20世纪80年代，开始对剑尾鱼进行实验动物化培育。研究发现剑尾鱼在细菌性疾病、水环境污染监测、遗传学研究等方面己初步显示出较好的应用前景。目前其两个主要品系RR-B(红眼红体)系和RW-H系(红眼白体)已分别近交培育达27代和15代。形态上近交系RR-B系和红眼红体的非选育剑尾鱼没有明显差异，因此很难从表型加以区分，建立准确可行的剑尾鱼近交系分子遗传监测方法势在必行。本论文试图利用RAPD-SCAR、微卫星和线粒体DNA标记，对近交系剑尾鱼分子遗传监测进行研究。
1．剑尾鱼RR-B系RAPD特异标记的SCAR转化
应用RAPD技术对剑尾鱼：RR-B系和非选育群体个体进行分析，从133条引物扩增结果中获得剑尾鱼RR-B系特有的分子标记S46<620bp>、S46<204bp>和S47<513bp>，对这些特异PCR条带进行回收、克隆和测序。根据序列信息合成新的引物，经PCR反应条件优化，分别产生了SC-1(620bp)、SC-2(429bp)、SC-3(204bp)、SC-4(156bp)、SC-5(513bp)和SC-6(329)6条扩增带，其中SC-2(429bp)在剑尾鱼RR-B系出现率为80％(8/10)，而在非选育群体为23．3％(7/30)；SC-1(620bp)、SC-3(204bp)、SC-4(513bp)、SC-5(513bp)和SC-6(329bp)扩增带在选育系与非选育群体中都呈阳性，不能有效区分这两个群体。SC-2(429bp)可作为判别剑尾鱼RR-B系和非选育群体遗传监测的辅助标记。
2．剑尾鱼RR-B系微卫星标记的遗传监测
通过参考GenBank和已报道文献，挑选49个微卫星座位设计引物，对红眼红体的非选育群体剑尾鱼进行PCR扩增，有46个微卫星座位能获得稳定的扩增产物。选择18个在野生剑尾鱼群体有多态性的微卫星座位，通过PCR扩增对剑尾鱼RR-B系(红眼红体)遗传质量进行分析。结果表明18个座位在30尾个体中均为纯合子，且为单态，18个微卫星座位基因纯合率达到100％，可作为剑尾鱼RR-B系的遗传监测标记，反映出剑尾鱼RR-B系经过20多代的近交培育已经具有很高的遗传均一性。
挑选在选育系剑尾鱼为单态纯合，而在非选育群体具有多态性的7个微卫星座位，对RR-B系与非选育群体剑尾鱼进行鉴定，座位Msa014鉴定RR-B系剑尾鱼排除概率为98.75％，座位Msd003排除概率为87.50％，其余5个座位排除概率介于两者之间。为方便今后的遗传监测，对RR-B系剑尾鱼样品的7个微卫星座位进行了测序，确定了其大小和具体的微卫星结构。利用最终确定的7个微卫星座位，初步建立了剑尾鱼RR-B系的分子鉴定方法。
3．多重PCR在剑尾鱼遗传监测中的应用
根据可明显鉴定剑尾鱼RR-B系的6对特异性微卫星引物Msa012、Msa014、Msa033、Msb025、Msd003、Msd051，采用不同的组合方式对RR-B系剑尾鱼和红眼红体的非选育剑尾鱼进行多重PCR扩增。结果表明，引物组合1(Msa014、Msb025、Msd003)和组合2(Msa012、Msa033、Msd051)两个三重PCR反应体系能有效的扩增各个微卫星
座位，且各目的片段之间无干扰，易于识别，引物组合1的排除概率为99.98％，引物组合2的排除概率为99.96％，能准确鉴定剑尾鱼RR-B系。本检测方法具有较高的稳定性，同时也大大提高了剑尾鱼RR-B系的遗传检测效率。
4.剑尾鱼RW-H近交系20个微卫星座位的遗传学分析
对水生实验动物剑尾鱼RW-H系近交15代的遗传结构进行研究，寻找该近交系的标志基因。选择20个在野生剑尾鱼群体具多态性的微卫星座位，对剑尾鱼RW-H系(红眼白体)30尾个体进行分析，结果表明其中有17个座位为单态，有可能作为该近交系的标志基因；其中仅3个座位Msa012、Msa033和Msc036具有多态性，多态信息含量值分别为0.3047、0.3457和0.3648。通过Pop-gene 3.2软件分析得知全部基因座基因纯合率达到了95.83％，个体间平均遗传距离为0.0482(0.0000-0.1500)，遗传相似系数为0.9518(0.8500-1.0000)，说明剑尾鱼RW-H系已经具有很高的近交程度，几个多态性座位的发现，可以指导近交选育，加快选育进度。
5.剑尾鱼线粒体DNA全序列的分析
参照近缘物种的线粒体基因组，设计了13对特异引物，通过PCR扩增、纯化、连接、克隆、测序和分析得到剑尾鱼非选育群体线粒体基因组全序列和近交系部分序列。结果表明，剑尾鱼近交系RR-B和非选育群体线粒体基因组全长都为16638bp，包括2个rRNA基因、22个tRNA基因、13个蛋白质编码基因和1个非编码控制区，基因的排列与已测序的近缘种鱼类相似。剑尾鱼近交系线粒基因组同非选育群体比对分析表明，初步共发现67个碱基核苷酸多态，为利用线粒体DNA标记对剑尾鱼近交系进行遗传监测打下基础。