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miRNA参与卵巢类固醇激素合成与分泌、细胞增殖与凋亡等多种生理过程,对卵泡发育具有重要的调控作用。课题组前期研究发现,miR-181a-5p在鹅卵泡颗粒层中高表达,可能参与颗粒细胞的增殖凋亡过程,有关miR-181a-5p在禽类颗粒细胞中的功能研究尚未见报道。因此,本研究利用生物信息学方法预测miR-181a-5p可能的靶基因及信号通路,在细胞水平上进一步探索miR-181a-5p对鹅颗粒细胞增殖凋亡的影响及其调控机制。其主要结果如下:(1)生物信息学分析表明,miR-181a-5p可能通过SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等靶基因参与FOXO信号通路调控颗粒细胞增殖凋亡过程。(2)qPCR结果分析表明,miR-181a-5p在2-4 mm表达最高,4-6 mm表达最低,之后在4-6 mm、8-10 mm、F5这三个阶段均呈现显著上升趋势。聚类分析发现,miR-181a-5p与其靶基因的表达模式在8-10 mm、F5阶段发生了较大的变化,而与细胞增殖凋亡相关基因SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN聚为一类,表明miR-181a-5p及其靶基因可能参与颗粒细胞增殖凋亡过程的调控。(3)通过浓度梯度转染mimic和inhibitor发现,在颗粒细胞中,mimic和inhibitor的最佳转染浓度分别为50 nM和120 nM。MTT检测结果显示,转染mimic能显著降低细胞活力(P<0.05),转染inhibitor能使细胞活力增强(P>0.05)。(4)在过表达miR-181a-5p后,细胞增殖标志基因PCNA和抗凋亡基因BCL2的表达均显著下降(P<0.05),而细胞凋亡相关基因TP53、BAX、CASP3表达显著上升(P<0.05)。在抑制miR-181a-5p后,呈现出相反的结果。表明miR-181a-5p具有抑制颗粒细胞增殖、促进凋亡的作用。(5)通过双荧光素酶报告系统检测发现,共转染野生型质粒和mimic时,荧光素酶活性显著下降(P<0.05),当结合位点被突变后,荧光素酶活性显著上升(P<0.05),表明miR-181a-5p可靶向结合SIRT1-3′UTR,抑制其mRNA水平的表达。(6)过表达miR-181a-5p后,FOXO信号通路的核心基因FOXO1及下游基因CDKN1A、CDKN1B的表达量均出现显著上升(P<0.05),而细胞存活调节因子AKT1表达量显著下降。表明miR-181a-5p可能通过靶基因SIRT1参与FOXO信号通路引起颗粒细胞凋亡。综上,miR-181a-5p可通过介导SIRT1参与FOXO信号通路调控颗粒细胞的增殖凋亡。本研究为深入探究miR-181a-5p在鹅颗粒细胞中的调控机制奠定了理论基础。