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以CRISPR-Cas9为代表的第三代基因编辑技术作为新兴的基因操作手段在基础研究、疾病防治、种质创新等领域迅速得到了应用和推广。在此背景下,水稻作为全球主要的粮食作物及重要的单子叶模式植物之一,无论从机理研究还是实际应用的角度出发,在其中探索和发展第三代基因编辑技术都显得极为重要。然而CRISPR基因组编辑系统的功能依赖于基因组上的一段特异性核苷酸序列,即PAM序列,这极大限制了该系统在水稻基因组中的可编辑范围。目前在水稻中广泛使用的SpCas9所识别的PAM序列为NGG,为了突破这一限制,本实验在水稻中从Cas9变体蛋白的创制、Cas9蛋白对非经典PAM编辑能力的挖掘、CRISPR-Cpf1体系的建立及优化等方面着手,通过密码子优化、定点突变等方法,在水稻中成功建立了识别NGA PAM的CRISPR-VQR基因组编辑系统、识别NGCG PAM的CRISPR-VRER基因组编辑系统及识别T富集PAM的CRISPR-Cpf1基因组编辑系统,丰富了水稻基因组编辑可选工具。该实验结果显示,三种基因编辑体系均能在水稻中有效地产生突变。经计算,水稻CRISPR-VQR/VRER基因组编辑体系的建立使水稻基因组中潜在可编辑的范围被拓展到原有的两倍以上。而在脱靶效应方面,VQR、VRER表现与Cas9类似,Cpf1则在本次试验中未检测到脱靶事件的发生。同时,本实验还对水稻CRISPR-VQR系统进行了效率优化。通过使用水稻Actin1启动子及序列优化后的sgRNA,成功将CRISPR-VQR系统的编辑效率提高了3至7倍。此外,在对CRISPR-Cpf1多基因编辑系统的优化过程中,本实验围绕crRNA及其表达方式进行了相关探索。其结果表明,相较于串联表达模式,利用tRNA-crRNA系统表达成熟的crRNA可以在低效位点产生更强的编辑效应。以上结果实现了CRISPR基因组编辑系统在水稻中编辑效率的进一步优化,为相关体系在水稻乃至其他物种中的使用提供了参考。此外,本实验还首次发现SpCas9在水稻中能够高效识别并编辑NAG PAM。从转基因实验的结果中可以发现其识别NAG PAM的能力几乎和NGG PAM相差无异。此外,实验结果还表明NGG PAM和NAG PAM能在多重基因编辑实验中同时被使用,这使得水稻CRISPR-Cas9技术的灵活性成倍增加。脱靶实验结果则显示,Cas9在识别NAG PAM的过程中产生的脱靶效应明显小于识别NGG PAM,表明使用NAG PAM进行水稻基因组编辑可能有利于减少脱靶事件的发生。