论文部分内容阅读
猪作为目前世界上饲养最广泛的肉用家畜,其产肉性能一直是研究者们关注的焦点。本研究室在利用LongSAGE技术对不同品种和不同发育阶段的猪胚胎骨骼肌进行全基因组转录谱研究的过程中得到6个差异表达基因,其中5个基因均与线粒体NADH呼吸链的功能有关。骨骼肌是一种代谢旺盛的器官,其肌纤维中含有丰富的线粒体,而线粒体是细胞中产生能量的主要部位,与线粒体功能相关的基因必然与肌肉的生长和品质有关。但是,目前对线粒体相关基因的研究集中于大肠杆菌、牛和人,在猪上还没有进行相关研究的报道。因此,本研究选择NADH呼吸链相关基因,以及与人类心血管疾病相关的.SMTN基因,以猪的骨骼肌为研究对象,用人×仓鼠体细胞杂种克隆板进行6个基因的染色体定位、CDS克隆和序列分析、用半定量RT-PCR进行时空表达谱分析、进行突变位点的筛选、并利用3个猪群的产肉性状资料进行基因型与性状的关联分析,以期初步了解这些基因的结构和功能,并为改进猪产肉性能的标记辅助选择提供资料。同时,利用3种小型猪群体的资料进行的性状关联分析结果可为其已经作为研究人类疾病的动物模型增添宝贵的种质特性与遗传学资料。
本研究的结果如下:
1.利用猪的EST信息分离了猪骨骼肌中差异表达的6个新基因,它们分别为NDUFAB1、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS5、NDUFS7和SMTN,获得了基因的基因组DNA片段,并对其序列进行了分析；
2.用猪×仓鼠体细胞辐射杂种板(IMpRH),对6个新基因进行了染色定位,分别将NDUFAB1基因定位于SSC3p,与标记S0174连锁,LOD值10.46；NDUFS2基因定位于SSC4q,与标记SW589连锁,LOD值8.52；NDUFS3定位于SSC2p,与标记SW1450连锁,LOD值13.46；NDUFS5定位于SSC6q,与标记SW1473连锁,LOD值11.14;NDUFS7定位于SSC2q21-q24,与标记SW395连锁,LOD值7.43；SMTN基因定位于SSC14q21-q22,与标记SW2612连锁,LOD值12.56。并与人的相应基因定位结果进行了符合性比较。
3.用猪的EST信息设计引物扩增,获得了6个基因的CDS,根据CDS序列对基因编码产物的结构和功能进行了预测,并对猪、人、牛和小鼠的相应基因进行了物种间进化树分析。NDUFAB1的CDS长471 bp,NDUFS2的CDS长1392 bp,NDUFS3的CDS长795 bp,NDUFS5的CDS长321 bp,NDUFS7的CDS长648 bp,SMTN的CDS长2475 bp。
4.利用半定量RT-PCR技术研究了6个新基因在猪的骨骼肌、心、肝、脑、脾、淋巴结、肺、肾、大肠、小肠和脂肪等11种组织中的表达情况,以及在33 d、65 d、90 d胚胎和成年猪骨骼肌中的表达情况。发现5个NADH相关基因在心、肝、脑、肾中的表达量都很高,而在骨骼肌中的表达量都较低。SMTN基因在脾中的表达量很高,而在骨骼肌、心、脑、肾中的表达量则较低。在不同发育阶段骨骼肌中的表达趋势则一致:6个基因在65 d胚胎的骨骼肌中表达量最高,90 d趋于降低,在33 d和成年猪的骨骼肌中表达量很低,这证实65 d左右的胚胎是肌纤维分化的最旺盛阶段,基因的表达水平较高,随后会逐渐降低。
5.利用DHPLC检测、EST拼接策略,对NDUFAB1、NDUFS3、NDUFS5和SMTN基因进行了多态位点的筛查,在NDUFAB1中发现一个G/A突变,可引起限制性内切酶MspA1I的切割位点改变；用DHPLC技术在NDUFS3中检测到1个Exon突变A/G,可引起氨基酸改变,有2个BFaI的酶切位点；在NDUFS5中检测到一个C/G突变；在SMTN中检测到一个C/T突变,该突变位于Exon,可引起氨基酸改变。
6.用DHPLC和酶切法对4个SNP在通城、大×长×通、长×大×通、大白、长白、贵州香猪、五指山猪和巴马香猪群体中的基因型频率和基因频率分布进行了检测,NDUFAB1基因的GG基因型频率0.526,GA基因型频率0.428,AA基因型频率0.046；对于基因频率,大白猪群的A等位基因频率高,而通城猪和长白猪的A等位基因频率极低。NNDUFS3基因的AA基因型频率0.699,AG基因型频率0.275,GG基因型频率0.026,A等位基因在各个群体中呈现优势分布；NDUFS5基因的CC基因型频率0.650,CG基因型频率0.312,GG基因型频率0.038,C等位基因显示出优势分布。可以得出结论:这3个基因的基因型呈严重的偏态分布。对于SMTN基因,TT基因型频率0.547,TC基因型频率0.267,CC基因型频率0.186,大×长×通群体中无TT基因型个体,五指山群体中无CC基因型个体,且CT基因型个体只有1个,贵州香猪群体中CC基因型个体只有3个,而巴马香猪群体中全部为TT基因型个体,因此对于基因频率,在地方品种中T等位基因分布占优势。
7.利用SPSS的GLM多因素方差分析法,对通城群体的15个生产性状指标进行了基因型和性状的关联分析。对于NDUFAB1基因,基因型与腿臀比率(Ham)极显著相关,其中GG基因型与GA基因型、GG基因型与AA基因型之间差异极显著,而GA与AA基因型之间差异不显著。基因型与肌内脂肪含量(IMF)显著相关,其中GG基因型与GA基因型、GG基因型与AA基因型之间差异极显著,而GA与AA基因型之间差异显著。基因型与其它性状无显著相关,但LSD比较发现平均日增重(ADG)、眼肌面积(LMA)、平均背膘厚(BF)、大理石纹评分(MS)、剪切力(Shear force)的基因型间两两比较有差异。对于NDUFS3基因:基因型与平均背膘厚趋于显著相关,其中AA与GG基因型差异极显著,AA与AG、AG与GG基因型差异显著。基因型与其它性状无显著相关,但LSD比较发现板油率(LFP)、平均背膘厚、肌内脂肪含量、屠宰率(DP)、腿臀比率和眼肌面积的基因型间两两比较有差异。对于NDUFS5基因:基因型与腿臀比率极显著相关,但基因型之间的差异不显著；基因型与达90kg日龄(Age)趋于显著相关,各基因型之间差异不显著。对于SMTN基因:基因型与腿臀比率极显著相关。基因型与平均日增重、肌内脂肪含量、平均背膘厚、屠宰率、眼肌面积无显著相关,但各基因型之间有差异。T检验法显示,血液生理生化指标甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、C反应蛋白(CRP)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的基因型间差异极显著,而载脂蛋白B(APO-B)、白细胞数(WBC)、大未染色细胞(LVC)、淋巴细胞百分数(LYMPH％)指标的基因型间差异显著,肌酐(CREA)的基因型间差异趋于显著,其它指标的基因型间差异不显著。