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盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(Ov-ASP-1)核心致病性相关结构域-1(PR1)具有很强的免疫佐剂活性,但先前报道的重组PR1带有组氨酸融合标签,不仅需用价格较贵的镍亲和层析柱纯化,而且因分子量较小容易降解。本研究将Ov-ASP-1 PR1分别与类弹性蛋白多肽(ELP)和ELK16自聚肽融合表达,以传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP2蛋白为模式抗原进行小鼠免疫试验,旨在简化重组PR1纯化工艺和探明不同纯化标签对PR1免疫佐剂活性的影响。首先将IBDV VP2基因序列优化成大肠杆菌密码子序列,5’端引入烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切位点,将合成序列插入pET-ELP载体,将重组载体pELP-VP2转化大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达,结果显示重组菌表达预期的67kDa融合蛋白。对ELP-VP2融合蛋白的相变温度和盐离子浓度进行优化,结果显示相变温度为28℃C,氯化钠浓度为2 mol/L。在优化条件下进行一次相变循环(ITC),纯化的ELP-VP2纯度为96%,产量为24mg/L。用TEV蛋白酶活性包涵体在30℃切割ELP-VP2融合蛋白6 h,切割效率为86%。用再次ITC去除ELP标签,回收的无标签重组VP2纯度为95%,产量为24 mg/L,能被IBDV VP2单抗识别。这些结果表明ELP是有效的重组蛋白纯化标签,制备的重组VP2可作为IBD亚单位疫苗进一步研发。将Ov-ASP-1 PR1基因片段分别插入ELP、ELK16和His标签融合表达载体,将重组载体pELP-PR1、pELK16-PR1和pET-PR1转化大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达,结果显示重组菌分别表达预期的60、28和23 kDa融合蛋白,其中ELP-PR1为可溶性表达,ELK16-PR1为活性包涵体表达,His-PR1为不溶性包涵体表达。分别用相变循环、离心洗涤和镍层析柱纯化融合蛋白,结果显示纯化的融合蛋白纯度分别为92%、95%和97%,产量分别为38 mg/L、96 mg/L和134 mg/L。这些结果表明ELP和ELK16自聚肽有效的重组蛋白纯化标签。分别用 VP2+ELP-PR1、VP2+ELK16-PR1 和 VP2+His-PR1 免疫小鼠,设 VP2 和 VP2+IFA(弗氏不完全佐剂)免疫对照组,首免后2周加强免疫一次,首免后第7、14、21和28天采血并收集血清,用间接ELISA测定免疫小鼠血清的特异IgG、IgG1和IgG2c;首免后28天扑杀小鼠,分离培养脾淋巴细胞,用WST-1法检测免疫小鼠脾细胞刺激指数,用试剂盒检测IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10表达水平。结果显示在初免后第7天,His-PR1佐剂组总IgG水平与VP2免疫组差异显著(P<0.05),IFA、ELK16-PR1和ELP-PR1佐剂组差异极显著(P<0.01),其中ELP+PR1佐剂组总IgG水平最高;His-PR1和IFA佐剂组IgG1水平与VP2免疫对照组差异不显著,ELP-PR1和ELK16-PR1佐剂组差异显著;4个佐剂组IgG2c水平与VP2免疫组差异极显著,其中ELP-PR1佐剂组IgG2c水平最高。初免后第28天,4个佐剂组总IgG水平与VP2免疫组差异极显著,其中ELP-PR1佐剂组总IgG水平最高;His-PR1佐剂组IgG1水平与VP2免疫组差异显著,其他3个佐剂组差异极显著;4个佐剂组IgG2c水平与VP2免疫组差异极显著,其中ELP-PR1佐剂组IgG2c水平最高。五个免疫组的脾细胞刺激指数分别为9.11±0.32、11.04±0.57、28.9±0.3、12.06±0.24和10.86±0.11,ELP-PR1佐剂组比VP2免疫组差异显著(P<0.01),其余佐剂组差异不显著。ELP-PR1佐剂组IFN-y水平比VP2免疫组差异极显著,其他3个佐剂组差异不显著;ELK16-PR1佐剂组IL-6水平比VP2免疫组差异显著,ELP-PR1佐剂组差异极显著;ELP-PR1免疫组IL-10水平比VP2免疫组差异极显著,其他3个佐剂组差异显著。这些研究结果表明携带不同融合标签的PR1仍保留免疫佐剂活性。