【背景和目的】免疫抑制是导致脓毒症患者高病死率的重要因素。PD-1及其配体PD-L1、PD-L2是一类重要的共抑制分子,PD-1/PD-L信号通路的激活可对免疫系统起负向调节作用。动物实验表明通过给予PD-1或PD-L1抗体阻断PD-1信号通路可以减少脓毒症导致的淋巴细胞凋亡,恢复单核细胞免疫功能,最终改善脓毒症小鼠的预后。本研究中,我们将首先阐明PD-1和PD-L1在脓毒症休克早期患者中的表达水平及其与疾病危重程度和预后的关系,进而探讨PD-1表达的调控机制,从而为脓毒症免疫治疗提供新思路。【实验方法】(一)临床研究根据2012年颁布的《严重脓毒症与脓毒症休克治疗指南》纳入符合脓毒症休克诊断的患者,在确诊24h内采集患者外周血7mL,并以健康志愿者为对照组。利用流式细胞术检测其外周血CD4~+T淋巴细胞及CD14~+单核细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平,比较脓毒症休克患者与健康志愿者之间以及患者死亡组与存活组之间的PD-1、PD-L1表达差异;同时分离获得两组人群外周血单个核细胞,利用Real-time PCR检测单个核细胞中Notch通路相关分子Notch1、Jagged1与Hes1的mRNA水平,并比较其在脓毒症休克患者与健康志愿者之间以及死亡组与存活组之间的差异。(二)体外实验利用人单核细胞系THP1细胞构建内毒素耐受细胞模型,共分为4组,分别为对照组,LPS非耐受组,LPS耐受组及LPS耐受+DAPT干预组(DAPT为Notch信号通路阻断剂)。利用Real-time PCR检测各组细胞中TNF-α、IL-10、PD-1以及Notch通路相关分子Jagged1、Hes1的mRNA水平,同时利用流式细胞术检测THP1细胞表面PD-1的表达水平,进而比较各组间PD-1、Jagged1、Hes1、TNF-α以及IL-10水平的差异。【结果】(一)临床研究1.与健康志愿者相比,脓毒症休克早期患者外周血中CD4~+T淋巴细胞及CD14~+单核细胞表面的PD-1、PD-L1水平均显著升高(CD4~+T淋巴细胞:21.59%vs 6.37%,p<0.001;13.67%vs 4.97%,p<0.01;CD14~+单核细胞:14.91%vs 6.89%,p<0.01;51.82%vs 17.12%,p<0.01);脓毒症休克早期患者外周血CD14~+单核细胞表面PD-1、PD-L1的水平与APACHEII评分呈正相关(r=0.52,p<0.0001;r=0.55,p<0.0001);与存活组相比,死亡组患者的CD14~+单核细胞表面的PD-1、PD-L1显著升高(19.13%vs 13.79%,p<0.05;60.21%vs 45.06%,p<0.01)。2.与健康志愿者相比,脓毒症休克早期患者外周血单个核细胞中的Jagged1与Hes1水平显著升高。与存活组相比,死亡组患者外周血单个核细胞中的Jagged1水平显著升高。(二)体外实验1.与内毒素非耐受组相比,内毒素耐受组的IL-10、Jagged1、Hes1以及PD-1的水平显著升高,TNF-α的水平显著降低。2.与非干预组相比,DAPT干预组的PD-1及IL-10的水平显著下降。【结论】1.脓毒症休克早期患者外周血PD-1、PD-L1表达升高,且其表达水平与疾病危重程度及临床预后相关。2.脓毒症休克早期患者外周血单个核细胞中存在Notch信号通路的激活。3.Notch通路参与调控脓毒症免疫抑制过程中PD-1的表达。