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D-阿洛酮糖是一种新型低热量的功能性因子,D-果糖的差向异构体,在自然界存在极少,可以应用于食品、医药和保健等领域。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPE)是一种可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖进行可逆反应的胞内异构化酶。鉴于D-阿洛酮糖多应用于食品领域,本文选用食品级微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主。本文构建了高效表达来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPE基因(CCDPE)以及来源于Ruminococcus sp.的DPE基因(RDPE)的重组枯草芽孢杆菌工程菌株。研究了CCDPE在重组枯草芽孢杆菌中的表达与纯化、酶学性质、酶的固定化以及与两种重组酶的理化性质比较等方面的内容。来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPE基因片段大小约为882 bp,蛋白分子量约为33 kDa。用LB-Kana培养基(Kana含量50μg/mL)在37℃、200 rpm条件下培养重组菌株,收获菌体后经超声波细胞破碎仪破碎、离心收集上清液,用Ni-NTA亲和层析柱和Source 15Q阴离子交换柱提纯目的蛋白。SDS-PAGE结果表明,目的蛋白为可溶性表达,条带特异性强,纯化效果较为理想,纯度可以达到90%以上。纯化的CCDPE酶酶学性质研究表明,其最适温度50℃、最适pH 8.0,其活性不依赖金属离子,但Co2+对其有强烈的促进作用,酶促动力学反应结果表明,该酶对D-阿洛酮糖具有较高的底物特异性。本文还采用了不同载体材料和固定方法对CCDPE粗酶固定化工艺影响的研究,综合得出,以壳聚糖为载体固定CCDPE粗酶效果比较好,在对固定化工艺条件优化后得出当固定时间为3 h,[酶]：[载体]=15：1(U/g)时酶活回收率最高为45%。另外,本文也采用此固定化方法对枯草芽孢杆菌中表达的Ruminococcus sp,的DPE粗酶进行固定化研究。对CCDPE自由酶、CCDPE固定化酶、RDPE自由酶和RDPE固定化酶的最适pH、最适温度以及金属离子等酶学性质进行比较,结果表明,对CCDPE而言,其固定化酶的最适温度(55℃)和pH(8.5)都高于自由酶(50℃、8.0)；对RDPE而言,其固定化酶的最适温度较自由酶相比没有明显改变,均为60℃,但其固定化酶的pH(9.0)高于自由酶(8.0); Ni2+、Cu2+和Zn2+均对CCDPE自由酶与固定化酶以及RDPE自由酶与固定化酶酶活性有抑制作用,C02+和Mn2+对CCDPE自由酶酶活性有强烈的促进作用,Mn2+和Fe3+还对RDPE自由酶酶活性有强烈的促进作用。将CCDPE固定化装入填充床反应器进行连续转化反应,并研究流速对反应产率和转化率影响。在最佳流速为2.5 mL/min时,转化率为19%,相关产率为6.7g/L-h。当固定化酶连续反应168 h,转化率能保持在13%以上。