水稻是世界上重要的粮食作物之一,其产量主要来自叶片的光合作用。叶绿素(Chlorophyll,Chl)是叶绿体内参与光合作用的重要色素,深入阐明水稻叶绿素合成的调控机制对水稻光能利用效率和产量潜力的遗传改良具有重要的指导意义。Light-harvesting complex(LHC)蛋白是植物光合机制 的重要组分,light-harvesting-like(LIL)蛋白是LHC中的重要一类。本研究利用CRISPR/Cas9创制了水稻OsLIL3基因的突变体,在此基础上初步解析了 OsLIL3在水稻叶绿素合成中的作用。主要研究结果如下:1、前期研究结果表明,LYL1编码一个双牻牛儿基还原酶(Geranylgeranyl reductase,GGR),发生突变会导致水稻叶绿素合成受阻。在拟南芥中,GGR与LIL3蛋白互作调控叶绿素合成。利用酵母双杂交技术分析了水稻中OsLIL3与LYL1之间的互作关系,发现两者在酵母系统中并不互作;2、我们利用CRISPR/Cas9技术,在日本晴背景下获得了 1个OsLIL3基因的纯合突变体,命名为oslil3-1,靶序列处缺失了 6个碱基,导致了 3个氨基酸的变异,但其余的氨基酸序列都没有发生改变。但鉴定到的其它突变体均为杂合突变体,我们推测完全敲除OsLIL3基因会导致幼苗死亡;3、在分蘖期,对oslil3-1纯合突变体最新抽出的3张叶片进行了叶绿素含量测定,发现oslil3-1纯突变体最新抽出叶片的总叶绿素含量约为野生型的70.3%,倒数第2张叶片的总叶绿素含量为野生型的40.5%,倒数第3张叶片的总叶绿素含量仅为野生型的34.5%。说明,oslil3-1突变体的叶绿素合成受阻,而且越早抽出的叶片黄化也越明显;4、利用透射电子显微镜对叶绿体进行观察,发现野生型含有大量的基粒类囊体,并且呈规则排布,但是oslil3-1突变体材料中几乎检测不到基粒类囊体存在,而与类囊体裂解有关的质体小球含量明显增多。因此,OsLIL3基因与水稻叶片中的叶绿体发育相关,并且OsLIL3突变后会导致叶片中叶绿体结构受损。5、氮蓝四唑(Nitro Blue Tetrazolium,NBT)染色发现,越老的叶片活性氧(Reactive oxygen species,ROS)积累越多,越嫩的叶片ROS积累越少。OsLIL3突变后会导致叶片中的ROS加速累积,这可能也是oslil3-1突变体叶片黄化的原因之一。6、持续光照和强光照会导致oslil3-1突变体叶片的叶绿素含量下降,说明光照是导致叶片黄化的重要原因。Western Blot分析表明,持续光照条件下,oslil3-1突变体中Lhca1、Lhca2、Lhcb2和RbcL含量比野生型有不同程度的下降。因此,OsLIL3基因突变后会影响光系统相关蛋白在持续光照条件下的稳定性。7、qPCR分析表明,光照会诱导OsLIL3的表达,但长时间的持续光照可能又会抑制其表达;OsLIL3基因在老叶中的表达量低于幼嫩叶片,在叶尖端表达量低于叶中部。