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第一部分低强度脉冲超声波促进人正常髓核细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖最佳声强度参数的筛选目的有报道证实低强度脉冲超声波(Low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS)能促进髓核细胞合成细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)主要功能性成分：Ⅱ型胶原(COLL2)和蛋白聚糖(Proteoglycan, PG)。本研究在国内首次使用人正常髓核细胞株(Human Nucleus Pulposus Cell Line, HNPC)接受LIPUS作用,筛选出使细胞产生最大量COLL2(?)(?)PG的强度参数(PG家族中研究最早最多的是Aggrecan,故以Aggrecan为代表检测)方法LIPUS(?)勺频率、作用时间等参数设定参考以往文献结果(频率1MHz,声脉20μs,重复1.0KHz的LIPUS,每天作用20分钟),设立5个LIPUS声强组：0、15、30、60、120mW/cm2,分别作用于HNPC,采用Real-time PCR检钡(?)COLL2(?)口Aggrecan对应基因的表达量,Western-Blotting检测(?)COLL2和Aggrecan蛋白的表达量,细胞免疫组化提供定性的形态学证据。结果COLL2和Aggrecan蛋白表达量趋势与其mRNA表达量趋势接近：COLL2基因和蛋白表达相对量在30、60mW/cm2两个声强组最多(此两组之间比较P>0.05,与其他组比较P<0.05), Aggrecan基因和蛋白表达相对量在60、120cmW/cm2两个声强组最多(此两组之间比较P>0.05,与其他组比较P<0.05)。但是,120cmW/cm2声强组COLL2蛋白和基因表达相对量明显下降(P<0.05)。结论选择60mW/cm2声强组作为促进COLL2和Aggrecan最大表达量的LIPUS声强参数。第二部分LIPUS对IL-1 p诱导HNPC退变模型合成基质能力的影响目的IL-1β可诱导HNPC基质合成能力下降,一定程度上模拟体内退变环境,建立退变细胞模型;探讨LIPUS对炎症因子作用环境中的HNPC合成ECM的影响。方法参考相关文献内容,使用IL-1β作用于正常HNPC48h后,建立退变的HNPC模型。采用声强为60mW/cm2,频率1 MHz,声脉20μs,重复1.0KHz的LIPUS.分组为：IL-1β+LIPUS(-)组、IL-1β+LIPUS(+)组、LIPUS(+)+IL-1β组。Real-time PCR检测COLL2、Aggrecan以及MMP-3、MMP-13对应基因的表达量,Western-Blotting检测相关蛋白的表达量,细胞免疫荧光检测提供LIPUS(?)乍用后COLL2、Aggrecan蛋白表达变化的形态学证据。结果LIPUS可以明显提升在炎性因子IL-1β刺激环境下COLL2和Aggrecan对应基因和蛋白的表达(P<0.05)。先接受LIPUS作用的正常HNPC,当LIPUS停止后加入IL-1β刺激,HNPC表达COLL2和Aggrecan对应基因的能力下降到与IL-1β+LIPUS(-)组相当；同时发现Aggrecan蛋白较COLL2蛋白下降明显；IL-1β上调MMP-3的作用强于上调MMP-13, MMP-3主要降解Aggrecan可能是Aggrecan下降更明显的原因。细胞免疫荧光表现支持以上结果。结论IL-1β可以有效的降低HNPC合成Aggrecan和COLL2的能力,构建出合理的模拟体内髓核退变状态的细胞模型；LIPUS促进模拟退变状态的HNPC合成Aggrecan、COLL2,具有潜在治疗价值,但促进作用在LIPUS停止后,下游效应不能持久,炎性刺激环境降低细胞功能。第三部分LIPUS促进HNPC合成COLL2、Aggrecan的机制研究目的LIPUS促进软骨和椎间盘细胞合成COLL2和Aggrecan,但具体机制不明。有报道证明LIPUS通过协同TGF-β1发挥对犬髓核细胞的正向调节作用。我们使用HNPC来探索LIPUS (?)勺作用机制,更接近人的实际情况。方法设计LIPUS组、LIPUS+TGF-β组和LIPUS+TGF-β1+TGF-β1中和抗体组,Real-time PCR检测COLL2、Aggrecan对应基因的表达量,细胞免疫荧光检测进一步提供LIPUS作用效果的直观证据;Real-time PCR检测LIPUS作用后TGFβR1mRNA的表达量；细胞免疫荧光技术检测连续时间LIPUS作用后Integrinα5β1与细胞骨架蛋白的联动效应。结果LIPUS+ TGF-β1组COLL2、Aggrecan对应基因表达相对量最大(P<0.05),免疫荧光结果与其一致；当加入足量的TGF-β1中和抗体后,效果发生了反转,COLL2、Aggrecan对应基因的表达量明显降低于单纯LIPUS作用组(P<0.05)。LIPUS刺激上调HNPC的TGFPR1基因表达；连续时间LIPUS作用后,HNPC表达Integrinα5β1量逐渐增多,细胞骨架逐渐解聚模糊,LIPUS停止作用后,Integrinα5β1不表达,细胞骨架重新构建。结论LIPUS促进HNPC合成COLL2、Aggrecan的机制为主要通过TGF信号通路。而且,LIPUS作用后,HNPC表达TGFβR1上调,提示LIPUS作用使得HNPC对TGF-β1的敏感性提高,以此模式发挥对TGF-β1的协同作用。LIPUS作为一种机械干预因素,其机械信号通过"ECM- integrinα5β1-F-actin"机械信号转导通路转换为HNPC内第二信号,调控细胞功能和状态。第四部分LIPUS对退变人髓核组织细胞合成COLL2、Aggrecan的影响[接要]目的初步探讨LIPUS对退变人髓核组织细胞合成COLL2、Aggrecan的影响。方法手术获得的人退变髓核组织细胞的分离、培养和鉴定。设计分组：LIPUS(+)组、LIPUS(-)组和DMEM/F12培养基作为阴性对照组；ELISA检测连续5次LIPUS作用,每次作用后上清液中的COLL2和Aggrecan含量；Western Blotting法检测LIPUS作用前、LIPUS作用5天后、自然生长5天后髓核细胞中COLL2和Aggrecan含量,评估LIPUS是否延缓了退变的进展。结果LIPUS作用下.连续测定培养基中COLL2和Aggrecan蛋白浓度变化趋势曲线先升后降,作用两次后,浓度达到最大,与作用前比较有统计学意义(P<0.05)；随后,曲线下降,达到接近作用前浓度水平。同期自然生长的退变髓核细胞培养基中COLL2和Aggrecan蛋白浓度呈现逐渐下降趋势,第5次作用后,蛋白浓度与LIPUS作用组相比较明显下降(P<0.05); Western Blotting结果显示：LIPUS(+)组与LIPUS作用前组比较,COLL2和Aggrecan相对量接近(P>0.05);与LIPUS(-)(?)且相比,蛋白相对量明显增多(P<0.05)。结论LIPUS作用使得退变人髓核细胞保持了合成分泌功能性基质分子的能力,延缓了其退变的进展。