随着生产需求的增加,我国甘草野生资源迅速减少,现以宁夏、内蒙古、甘肃、新疆等西北地区大面积人工种植为主,而市场上的栽培甘草质量参差不齐。除了大量的临床需求,甘草中的单体成分如甘草酸等化合物的在食品、化妆品行业的应用也十分广泛,因此提高栽培甘草品质显得尤为重要。甘草为耐盐中药材,盐胁迫环境与甘草药材品质密切相关,适度盐胁迫可促进甘草有效成分的合成与积累,提高其药材质量。然而,盐胁迫如何影响甘草有效成分的合成积累及甘草药材品质形成机制至今尚未阐明。因此,甘草的品质评价及盐胁迫下品质形成机制研究,是缓解野生甘草资源紧张,提升栽培甘草品质的重要环节。1.基于UFLC-QTRAP-MS/MS技术分析甘草多元指标成分本项目优化建立了 UFLC-QTRAP-MS/MS技术同时测定甘草中多元指标成分含量的方法,综合评价不同产地及不同生态型甘草中活性成分含量。聚类分析结果显示多数野生甘草与栽培甘草分界明显,说明不同生态型对甘草活性成分的含量影响较大。进一步将宁夏盐池产地的野生与栽培甘草分为主根上、中、下、侧根和根茎五个部位,研究活性成分在不同生态型甘草中不同部位的含量分布情况。野生甘草根茎外形粗壮,其活性成分总量与栽培甘草根茎的差异最大。总体含量结果表明,即使被分为不同部位,野生与栽培甘草仍各自聚为一类。且不论是初生还是次生代谢产物,栽培甘草中两大类成分的整体含量均低于野生甘草。具体来看,甘草酸,甘草苷,异甘草苷,芹糖甘草苷,芹糖异甘草苷,新甘草苷,甘草查尔酮A和4’,7-二羟基黄酮在野生甘草中含量较高。而甘草素,刺甘草查尔酮,芒柄花素和甘草查尔酮B的含量结果相反。2.野生与栽培甘草的代谢组学和iTRAQ蛋白质组学分析通过UFLC-Triple TOF-MS/MS非靶向代谢组学研究,鉴定出野生栽培甘草中63种化学成分,包括三萜类、黄酮及其相应糖苷类成分。主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和 t 检验分析结果表明甘草酸、licorice-saponin J2/G2、glyasperin D和dehydroglyasperin D可被视为区分野生和栽培甘草的化学标记物。根据野生和栽培甘草iTRAQ蛋白质组学比较分析,筛选出参与碳水化合物和重要氨基酸合成代谢的差异蛋白。此外,在野生甘草中还高表达了一些与抗非生物胁迫相关的酶,包括bglB,bglX和过氧化物酶。结合活性代谢物的含量研究,脯氨酸和精氨酸在野生甘草中含量更高,异甘草素含量没有显著差异,多数黄酮苷元类成分在野生甘草中含量低于栽培品,而黄酮糖苷类成分在野生品中更高,结果初步显示直接相关的合成酶表达趋势与下游代谢产物的含量并不完全一致。3.盐胁迫下甘草生化指标、关键酶基因表达及活性成分含量动态变化研究通过模拟甘草生长的盐环境,对甘草幼苗进行高盐(200mM NaCl)、中盐(100mM NaCl)、低盐(50mM NaCl)和对照(OmM NaCl)四个盐浓度水平的盐胁迫研究。观察记录甘草植株的形态学变化,发现对照组和高盐胁迫组的幼苗生长发育情况均弱于其他两组。胁迫期间分四次动态检测不同处理组甘草的生理生化指标:过氧化物酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)和过氧化氢酶(CAT)和关键酶基因β-香树脂合成酶(bAS)和查尔酮合成酶(CHS)表达水平以及16种三萜及黄酮类成分含量变化。结果表明,短期胁迫下,高盐胁迫组甘草的关键酶基因表达和活性成分含量会显著提高,但胁迫期间波动较大。而低浓度盐在不损害甘草正常生长的基础上最有利于活性成分的积累。4.盐胁迫下甘草的多组学研究盐胁迫结束后(50天),选择低盐(50mMNaCl)胁迫和对照组甘草样本进行有参转录组学、TMT蛋白质组学和非靶向代谢谱比较分析。根据蛋白质组学结果,筛选出三萜和黄酮这两大类活性成分合成途径中的关键差异酶。其中苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)、肉桂酸4-羟基酶(C4H)、4-香豆酸酯:CoA连接酶(4CL)、查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)和黄酮醇合酶(FLS)均在盐胁迫组中高表达。三个甘草酸生物合成关键酶bAS、CYP88D6和CYP72A154均在盐胁迫组中显著上调。根据转录组学结果,筛选出三萜和黄酮这两大类活性成分合成途径中的关键差异基因。其中与黄酮类生物合成途径相关的差异基因79个,与三萜类合成途径相关的差异基因28个,除了一个差异基因外,其他均在盐胁迫组中显著上调。通过PRM和qRT-PCR技术,对一些关键酶和关键基因进行了表达量的验证。根据UFLC-Triple TOF-MS/MS非靶向代谢研究,鉴定得到121个共有的次生代谢产物。主要包括三萜类化合物和五类黄酮化合物(黄酮(醇)、异黄酮、异黄烷、二氢黄酮(醇)和查尔酮),其中黄酮糖苷及多数三萜皂苷类成分相对含量在盐胁迫组中较高,而黄酮苷元类成分的含量结果相反。5.盐胁迫下甘草组学间的关联分析结合活性代谢产物含量与上游差异蛋白(基因),绘制甘草三萜及黄酮类成分生物合成途径。在低盐胁迫和对照组甘草比较蛋白质组和含量测定的联合分析中,结合14种生物活性成分含量,发现关键差异蛋白的表达情况与下游黄酮糖苷类成分含量变化一致,与上游查尔酮及黄酮苷元类成分含量变化相反。在低盐胁迫和对照组甘草转录组学和非靶向代谢谱结果联合分析中,发现差异基因的表达趋势与糖苷、三萜类成分的相对含量呈正相关,而80%的差异UDP-糖基转移酶基因也在盐胁迫组显著上调,因此推测糖基转移酶是导致糖苷类成分在盐胁迫组中积累较多而苷元类成分积累较少的关键因素。此外,MYB和bHLH转录因子家族也参与调节黄酮生物合成和非生物胁迫,二者在盐胁迫和对照组中也有显著差异。最后结合转录组学和蛋白质组学的联合分析结果,筛选出两个功能潜力最大的甘草糖基转移酶基因(Glyur000289s00018722 和 Glyur002678s00045101)。综合以上结果,本实验最终揭示了甘草中有效成分积累与合成酶(基因)之间的逻辑关系。发现盐胁迫环境影响甘草活性成分积累的分子机制不仅是上游合成酶(基因)的差异表达,下游糖基转移酶的表征和功能研究也是一个重要方向。