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Holomycin和thiolutin是二硫吡咯酮类抗生素中最具代表性的两个化合物,具有广谱的抗菌活性及潜在的抗肿瘤活性。为了阐明它们的合成机制,本研究对holomycin和thiolutin生物合成基因簇中的多个关键酶进行了表达和纯化。其中,3个非核糖体多肽合成酶HlmE、AutE和ThiE,酰基转移酶AutA和ThiA2都能通过诱导表达得到较多的可溶性蛋白;酰基转移酶HlmA、ThiAl和硫酯酶HImC能通过诱导表达得到较少的可溶性蛋白,需要加大诱导量;而硫酯酶HlmK和酰胺合成酶HlmL虽然能够表达但是以包涵体形式存在,无法用于后期体外功能的检测。为此,我们以来自玫瑰色红球菌J1的腈水解酶诱导表达系统PnitA-NitR为基础,尝试在链霉菌宿主中建立蛋白诱导表达系统。结果发现这个系统无法正常工作,无论是目的蛋白还是诱导调控蛋白NitR均以包涵体的形式表达,且表达量较低。来自硫藤黄链霉菌的蛋白Orf4功能未知,早期研究发现蛋白Orf4的表达可在多种宿主中上调抗生素的产量。生物信息学分析显示其带有N端的7次跨膜区和C端的胞内结构域。为了探索Orf4的具体功能和作用机制,首先在大肠杆菌宿主中进行了蛋白的表达和纯化,成功获得仅包含C端胞内结构域的截短蛋白Orf4(247),并利用纯化后的蛋白制备了相应的抗体。尝试使用pull-down方法筛选与Orf4有相互作用的蛋白,结果一无所获。同时对Orf4(247)蛋白是否具有磷酸化活性进行了分析,发现Orf4既不能进行自磷酸化反应同时还无法被FastAP碱性磷酸酶脱磷酸化,表明Orf4无磷酸化活性。使用抗体对表达Orf4蛋白的链霉菌宿主S.lividans ZX1::pZMYORF4进行Western blot分析,结果显示它与含空载体的对照菌株没有明显差异,暗示着Orf4蛋白在链霉菌中表达量很低或没有表达。pZMYORF4克隆的序列分析显示它的插入片段除了包含orf4基因的阅读框以外,还包含其下游390 bp的DNA片段,其中有99 bp的间隔序列以及下游orf5基因(P450氧化酶基因)的部分编码序列。去除390 bp的未知序列后,仅orf4基因的异源表达几乎丧失了提高抗生素产量的功能,而将这390 bp的DNA片段插入到载体中构建的克隆pZX02在异源表达时可以刺激十一烷基灵菌红素的产生,其对抗生素产量的影响弱于同时包含orf4和部分orf5的pZMYORF4。