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目的:利用慢病毒干扰技术研究低氧性肺动脉高压(HPH)模型小鼠中HMGB-1对TDAG8表达的影响及炎症反应的调控作用,并阐明其相关信号通路。方法:18只SD小鼠随机分正常组(NC组)、低氧组(HPH组)、HMGB-1基因干扰组(HPH+HMGB-1~-组),HPH组常压低氧法建立低氧肺动脉高压小鼠模型,HPH+HMGB-1~-组分别在低氧造模d10、d20向小鼠尾静脉HMGB-1特异性shRNA慢病毒实现基因干扰,持续28天造模成功后,留取血液及组织标本。器官水平评估模型建立情况及慢病毒干扰效果:(1)评估右心肥厚指数及病理切片评估肺动脉血管重塑情况;(2)活体荧光示踪法及组织冰冻切片验证小鼠尾静脉HMGB-1特异性shRNA慢病毒注入实验小鼠体内情况。细胞水平:检测慢病毒介导shRNA干扰HMGB-1在小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的表达效果。基因水平:(1)RT-PCR检测模型小鼠肺组织中HMGB-1mRNA表达;(2)Western-blot检测HMGB-1、TDAG8蛋白表达及ERK磷酸化水平。分子水平:ELISA检测肺泡灌洗液中HMGB-1、TLR4、NF-KB、IL-6、IL-1β、HIF-1的表达及cAMP累积量表达水平。方差分析检验组间差异,Pearson分析法分析相关性。结果:1、低氧性肺动脉高压小鼠模型建立成功:(1)28d后小鼠的平均体重:HPH组较NC组明显下降,P=0.0001;HPH+HMGB-1~-组较NC组下降,P=0.001;HPH+HMGB-1~-组较HPH组下降,P=0.01;右心肥厚指数(RVHI)在三组间均具有统计学意义,P<0.05;(2)病理切片结果显示肺动脉管腔形态:NC组大鼠肺动脉壁正常,HPH组较NC组肺动脉壁增厚管腔严重狭窄,P=0.0001;HPH+HMGB-1~-组较NC组管腔狭窄,P=0.001;HPH组较HPH+HMGB-1~-组肺动脉壁增厚及管腔明显狭窄,P=0.01,综上证明HPH造模成功。2、HPH炎症因子表达上调,HMGB-1信号转导通路激活:肺组织中HMGB-1mRNA及HMGB-1蛋白、肺泡灌洗液中HMGB-1表达在HPH组较NC组中高表达,P<0.05,证明HPH中HMGB-1表达增高;肺泡灌洗液中TLR4、NF-KB、IL-1b、IL-6在HPH组较NC组高表达,P<0.05;Pearson相关性分析提示HPH组HMGB-1的表达分子水平与基因及蛋白水平呈正相关,P<0.05;Pearson相关性分析提示HMGB-1与TLR4、NF-KB、IL-1β、IL-6呈正相关,表明HPH中HMGB-1表达增高,炎症因子IL-1β、IL-6表达上调,TLR4/NF-kB信号通路激活。3、尾静脉注射HMGB-1特异性shRNA慢病毒,显著抑制了肺组织中HMGB-1的mRNA和蛋白表达,炎症因子下调,减轻炎症反应:(1)巨噬细胞RAW264.7中验证HMGB-1 shRNA慢病毒干扰效果:PCR检测转染HMGB-1shRNA慢病毒后,HMGB-1 mRNA表达明显减低,P<0.05。(2)活体荧光示踪法和组织冰冻切片均可验证小鼠尾静脉注射HMGB-1特异性shRNA慢病毒成功。(3)肺组织中HMGB-1mRNA及HMGB-1蛋白、肺泡灌洗液中HMGB-1表达HPH+HMGB-1~-组较HPH组表达下降,P<0.05。Pearson相关性分析提示HPH+HMGB-1~-组HMGB-1的表达分子水平与基因及蛋白水平成正相关,P<0.05,有统计学意义。肺泡灌洗液中TLR4、NF-KB、IL-1b、IL-6在HPH+HMGB-1~-组较HPH组低表达,P<0.05。4、HPH中HIF-1表达升高:肺泡灌洗液中HPH组较NC组较明显增高(t=6.53,P=0.0001);HPH组较HPH+HMGB-1~-组明显升高(t=3.77,P=0.001)。直线相关性分析提示HIF-1与HMGB-1表达呈正相关。5、HPH中HIF-1表达升高,导致微酸环境,TDAG8/cAMP表达激活:(1)小鼠肺组织中TDAG8蛋白表达水平在HPH组较NC组中高表达,P<0.05;(2)ELISA法检测肺泡灌洗液中cAMP累积量增加:HPH组较NC组明显增高(t=8.54,P=0.0001),具有统计学意义。Pearson相关性分析提示TDAG8与cAMP呈正相关性;HIF-1与TDAG8、cAMP表达呈正相关。6、HMGB-1介导的HPH炎症反应中,HIF-1表达升高,乳酸堆积,形成酸性环境,TDAG8/cAMP通路激活,预测HPH中HMGB-1能正反馈调节TDAG8的表达:HPH组较NC组TDAG8及cAMP高表达,P<0.05,有显著性;HPH+HMGB-1~-组较HPH组TDAG8及cAMP低表达,P<0.05,有统计学意义。Pearson相关性分析提示HMGB-1与TDAG8、cAMP的表达呈正相关。结论:1、低氧性肺动脉高压小鼠模型建立成功;2、HPH中HMGB-1mRNA和蛋白表达明显升高,炎症因子(IL-1、IL-6)上调,激活TLR4/NF-kB信号通路,HMGB-1与TLR4、NF-kB、IL-1、IL-6呈正相关,表明HPH中HMGB-1介导炎症反应;3、HPH中HIF-1表达升高,TDAG8、cAMP表达升高,HIF-1与TDAG8、cAMP呈正相关,表明HIF-1激活TDAG8/cAMP信号通路;4、HMGB-1基因干扰后,炎症因子表达下调,病理结果示HPH+HMGB-1~-组肺动脉管腔狭窄程度较低氧组明显减轻,表明HPH炎症反应减轻;5、HPH组TDAG8、cAMP表达升高,TDAG8负调控炎症因子作用增强,HPH+HMGB-1~-组TDAG8、cAMP表达下降,HMGB-1信号转导通路调控炎症反应占主导地位,本实验预测HMGB-1正反馈调节TDAG8的表达。