酶解改性苹果渣中多糖的制备、结构解析及脂质代谢调控机制

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苹果渣的综合利用是困扰苹果深加工可持续发展的难题,目前除小部分苹果渣经粗加工用作动物饲料外,大部分都作为废弃物丢弃,严重浪费资源和污染环境,因此苹果渣的高附加利用是一个亟待解决的问题。脂质代谢紊乱可导致肥胖,同时是冠心病、动脉硬化、脂肪肝、糖尿病、高血压等疾病的主要危险诱因之一。已有研究表明植物多糖具有脂代谢调节的功能。本论文以苹果渣为原料,采用酶解方法改性苹果渣,综合果渣中多糖的收率与降脂性能相关的体外物性变化规律,优化苹果渣酶解工艺。通过与未处理苹果渣中多糖(Polysaccharides from apple pomace,PAP)对比,研究酶解改性后苹果渣中多糖(Polysaccharides from enzymatic apple pomace,PEAP)的结构变化、体外抗氧化活性及构效关系,并基于高脂膳食诱导肥胖小鼠模型研究PEAP的体内降脂活性及脂质代谢的调节机制。主要研究内容和结果如下:(1)以PEAP得率为指标,采用单因素和响应面实验优化酶解改性苹果渣(Enzymatic apple pomace,EAP)制备工艺参数并探讨EAP降脂相关物性。实验结果表明,EPA微观结构发生了明显变化,形成较多大的空腔和明显的裂缝,具有更大的比表面积,暴露出更多的亲水和亲油基团,EPA的持水力、持油力、膨胀力及胆固醇和胆酸盐的吸附能力得到提高。Pearson相关分析显示,PEAP收率与酶解改性苹果渣的物性之间密切相关。响应面优化实验得最佳工艺为:料液比为1:20、采用纤维素酶与果胶酶构成的复合酶(纤维素酶20 U/g;果胶酶80 U/g)、酶解时间5.5 h、酶解pH 5.1、酶解温度44℃,该工艺条件下PEAP收率可达16.84%。(2)对比PAP研究了 PEAP的结构与体外抗氧化活性。结构方面:二者同为主链同含有α型与β型糖苷键的酸性多糖,单糖类型相同,但具体单糖含量存在差异,PEAP的半乳糖醛酸(Galacturonic acid,GalAc)含量高出PAP含量20.01%;分子量分布有明显差异,PAP的主体Mw大于 50kda,其中 2002Mw≥50kDa 占 PAP 的 93.9%,而 PEAP 的主体 Mw 处于50≥Mw≥4kDa区间,占PEAP的92.1%;体外抗氧化活性实验结果表明,PEAP对·OH、O2-·、DPPH·与ABTS+·清除活性强于PAP,这归因于PEAP的GalAc含量高于PAP含量且PEAP具有较低的分子量。(3)对纯化PEAP所得三种多糖PEAPw、PEAP1与PEAP2的进行结构表征及体外抗氧化活性研究。PEAPw为主链含有α型与β型糖苷键的中性多糖,由岩藻糖(Fucose,Fuc)、阿拉伯糖(Arabinose,Ara)、鼠李糖(Rhamnose,Rha)、半乳糖(Galactose,Gal)、葡糖糖(Glucose,Glc)和木糖(Xylose,Xyl)六种单糖组成,主体糖苷键为:1,4-α-D-linked Glcp、1,4-β-D-linked Glcp、1,4-β-D-linked Galp与 1,4,6-β-D-linked Glcp,Mw=6.461 kDa,分子构型为无规则线团构型;PEAP1为主链含有α型与β型糖苷键的酸性多糖,由Fuc、Ara、Rha、Gal、Glc、Xyl、甘露糖(Mannose,Man)、GalAc 及葡糖糖醛酸(Glucuronic acid,GlcAc)九种单糖组成,糖醛酸含量为14.67%,主体糖苷键为:1,4-α-D-linked GalAcp、1,4-β-D-linked GalAcp、T-α-L-linked Araf、T-β-D-linked Xylp,Mw=45.164 kDa,形貌为表面形成了许多球形的突起的不规则片状聚集态;PEAP2为主链含有α型与β型糖苷键的酸性多糖,由Fuc、Ara、Rha、Gal、Glc、Xyl、GalAc及GlcAc八种单糖组成,糖醛酸含量为18.17%,主体糖苷键为:1,4-α-D-linked GalAcp、1,4-β-D-linked GalAcp、1,2-α-L-linked Rhap、T-β-D-linked Xylp,Mw=41.698 kDa,分子构型为高支化结构。体外抗氧化活性实验结果表明,PEAP、PEAPw、PEAP,与PEAP2四种多糖对·OH、O2-·、DPPH·与ABTS+·清除活性均呈现出浓度变化正相关,PEAP的自由基清除能力高于纯化糖;纯化后的三类糖的自由基清除能力最好的是PEAP2。(4)基于高脂膳食诱导肥胖小鼠模型对PEAP的体内降脂作用进行研究。小鼠表型数据、生化指标和组织形态学切片结构表明PEAP具有降脂作用。PEAP可以降低高脂膳食诱导的肥胖小鼠的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、丙二醛的含量,提高超氧歧化酶及过氧化氢酶的含量,说明PEAP能够改善血脂,对小鼠的机体脂质代谢紊乱有修复作用;组织形态学的实验结果表明,PEAP组小鼠肝脏的脂滴体积与数量均减少,脂肪细胞的直径也呈减小的趋势,说明PEAP能减少小鼠脂肪生成,并能在一定程度上改善小鼠受损伤的肝脏状况。Spearman相关性分析表明PEAP降脂过程中生化指标与氧化指标之间密切相关。(5)基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学方法,初步筛选出和脂质代谢相关的51种潜在的生物标记物及其参与的5条代谢通路。分析结果表明,在高脂膳食诱导下,小鼠血清代谢谱发生了显著性变化,PEAP可通过升高小鼠血清中左旋肉碱、磷脂酰胆碱含量调节脂质代谢,减少脂肪生成;同时降低溶血磷脂酰胆碱含量,改善小鼠体内氧化应激水平,调节甘油磷脂代谢;且PEAP可能调控戊糖和葡萄糖醛酸转换通路、减轻高脂膳食诱导的机体炎症反应,进而改善脂质代谢失衡情况,发挥降脂效果。(6)采用蛋白免疫印迹方法进一步确认PEAP改善肥胖小鼠脂质代谢紊乱是通过如下途径综合作用结果,其一,通过增强腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的活化,抑制过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome proliferator activated receptor-y,PPAR-y)的表达,进而实现减少前脂肪细胞分化及甘油三脂形成。其二,增加磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(Phosphatidylinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路的磷酸化,使通路活化水平上升,改善胰岛抵抗,促进脂质分解,改善紊乱,实现糖脂代谢平衡。本研究发现酶解改性后的苹果渣多糖具有更好的体外抗氧化和体内降脂活性,阐释了 PEAP抗氧化活性获得提高的结构原因,对纯化糖PEAPw、PEAP1与PEAP2进行结构表征、确证了微观形貌,本论文的完成为延伸苹果加工产业链,实现苹果渣的高附加值利用奠定理论基础。
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