研究背景:病毒性胃肠炎,又称病毒性腹泻,是一种影响所有年龄段人的常见疾病,每年造成严重的全球性的社会和经济负担,容易造成婴幼儿和老年人严重脱水引发并发症甚至死亡。其主要由轮状病毒、诺如病毒等病毒引起,严重危害大众健康和日常生活。由诺如病毒或轮状病毒感染引起的病毒性胃肠炎每年将造成高额的经济负担,因此各国科研人员努力制造有效的疫苗。针对轮状病毒的预防疫苗已有被批准使用的商品化疫苗,且具有良好的免疫效果。而诺如病毒预防性疫苗还没有被批准使用的商品化疫苗,部分研究处于临床阶段试验。因此本论文针对诺如病毒疫苗进行研究。诺如病毒(Norovirus,NoV)是目前引起全世界急性胃肠炎的主要病原体之一,每年约造成6.99亿人次的感染。NoV为RNA病毒,易变异,环境耐受强,具有极高的传染性,是诱发大规模传染的潜在病原。在2016年冬季GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒开始在亚洲地区出现流行,其具有很强的感染性和复制性特点,说明了该毒株大流行的潜力,已受到人们关注。创新点:1.确定了吉林省部分地区病毒性胃肠炎流行特征。2.成功获得了 GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒病毒样颗粒(VLPs)以及表达GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒VP1蛋白的重组植物乳杆菌Lac.VP1,免疫后可以刺激小鼠产生细胞及体液免疫应答反应。3.证实了重组植物乳杆菌Lac.VP1通过TRAF2/NF-κB信号通路的激活,诱导树突细胞(DCs)成熟进行抗原递呈,诱导T细胞向Th1型分化,初步阐述重组植物乳杆菌免疫机理。研究目的:探索吉林省部分地区病毒性胃肠炎的流行特征,为病毒性胃肠炎防控提供数据支撑;构建了 GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒的VLPs是以及重组植物乳杆菌,并对两种基因工程疫苗免疫原性进行了免疫效果评价。并对重组植物乳杆菌Lac.VP1对DCs的免疫应答机理进行了进一步研究,为诺如病毒新型疫苗的研发和免疫机理研究提供理论支持。研究方法:1.收集吉林省部分地区腹泻患者的样品,利用RT-PCR进行检测,分析吉林省病毒性胃肠炎的感染情况。2.通过杆状病毒表达系统制备GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒的VLPs,并利用 PCR、Western blot、Indirect immunofluorescence assay(IFA)以及透射电镜观察等检测技术,构建并鉴定诺如病毒VLPs。3.通过PCR、Western blot、IFA、流式细胞检测以及扫描电镜和透射电镜观察等检测技术,构建并鉴定诺如病毒重组植物乳杆菌Lac.VP1。4.通过Western blot、CFDA-SE染色流式细胞检测以及小动物成像等检测技术,分析了重组植物乳杆菌Lac.VP1的体内定植增殖情况;并利用Western blot、血常规检测以及HE染色等实验方法,分析了重组植物乳杆菌Lac.VP1的体内病理损伤情况。5.通过免疫小鼠后特异性IgG检测、IgG分型检测、B淋巴细胞活化、T淋巴细胞活化与增殖、T淋巴细胞亚型检测以及CD8+记忆T淋巴细胞检测等检测手段,分析评价了两种基因工程候选疫苗的免疫原性。6.通过了流式细胞仪检测、细胞因子检测、qPCR、Western blot、IFA以及免疫组化等实验方法,分析了重组植物乳杆菌Lac.VP1和树突细胞(DCs)之间的相互作用关系以及Lac.VP1对DCs激活递呈机制通路。研究结果:1.通过RT-PCR检测了吉林省部分地区病毒性胃肠炎患者的临床样本,明确了病毒引起腹泻率为27.62%,其中轮状病毒为主要感染病原,占58.14%。而诺如病毒引起的病毒性胃肠炎占9.30%。2.PCR、Western blot、IFA以及电镜观察等结果表明,利用杆状病毒表达系统成功获得了诺如病毒VLPs。3.PCR、Western blot、IFA等实验结果表明,重组植物乳杆菌可以表达诺如病毒的VP1蛋白。并通过扫描电镜以及透射电镜观察重组植物乳杆菌的形态,证明了重组植物乳杆菌可以表达的VP1蛋白成功并锚定在重组植物乳杆菌菌体表面。4.Western blot结果表明,连续传代、诱导时间、人工胃液和人工肠液对重组植物乳杆菌表达诺如病毒VP1蛋白没有影响,证明了 Lac.VP1的稳定性;通过流式细胞仪以及小动物成像系统观察CFDA-SE染色的Lac.VP1体内定植情况,证明了重组植物乳杆菌Lac.VP1可以定植在体内并增殖;重组植物乳杆菌Lac.VP1可以体外诱导Caco-2细胞高表达ZO-1、Claudin-1以及Occludin等紧密连接或闭合蛋白,证明Lac.VP1可以增强细胞对病原的抵抗能力。通过血常规检测、体重/生存观察以及HE染色等实验方法,确证了重组植物如杆菌Lac.VP1体内的安全性。5.免疫小鼠后,诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌可以产生特异性IgG,并且诱导活化B淋巴细胞。T淋巴细胞增殖与活化检测结果表明,当存在病原体刺激时,诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌免疫组T淋巴细胞可以快速增殖与活化。免疫后28d时,诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌免疫组可以产生CD8+记忆T细胞。诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌组各项检测指标均显著高于对照组,表明诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌候选疫苗具有良好的免疫原性。6.通过重组植物乳杆菌与小鼠骨髓分离培养的DCs共同孵育,利用流式细胞检测技术,证明了重组植物乳杆菌Lac.VP1可以诱导DCs成熟,MHC-Ⅱ高表达作为第一信号,共同刺激因子CD40、CD80以及CD86的高表达作为第二信号,IL-6等细胞因子的分泌作为第三信号共同作用T细胞,诱导Th0向Th1类淋巴细胞分化。检测重组植物乳杆菌Lac.VP1免疫小鼠后肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴中DCs的情况,确定了肠组织中DCs可以摄取Lac.VP1并向肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴迁移,作用T细胞促进T细胞分化。Western blot检测技术检测到重组植物乳杆菌Lac.VP1与DC2.4细胞共同孵育后通过检测TRAF家族(TRAF1、TRAF2、TRAF3以及TRAF6)以及NF-κB通路中的关键蛋白(NF-κB p65、NF-κB p50、phospho-IKK-α/β、IKB-α 以及 phospho-NF-κB-p65 等),表明重组植物乳杆菌Lac.VP1可激活TRAF2/NF-κB信号通路,诱导DC细胞成熟活化进行抗原递呈。通过荧光显微镜观察到重组植物乳杆菌Lac.VP1孵育组的DC2.4细胞内NF-κB p65高表达并成细胞核转运,确定了重组植物乳杆菌Lac.VP1激活了 DCs的NF-κB通路进行了抗原递呈和免疫诱导。研究结论:1.吉林省部分地区27.62%的胃肠炎是由病毒引起,其中轮状病毒为主要感染性病原,占病毒性胃肠炎的58.14%。而诺如病毒的感染占总数的为9.3%。2.通过重组杆状病毒表达系统成功制备GⅡ.P16-GⅡ.2型的VLPs。3.成功构建表达GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒VP1蛋白的重组植物乳杆菌Lac.VP1。4.重组植物乳杆菌Lac.VP1可以在小鼠肠道中定植并增殖,且不造成肠组织损伤。5.诺如病毒VLPs以及重组植物乳杆菌免疫后28d,可以产生特异性IgG及CD8+记忆T细胞、并诱导活化T淋巴细胞和B细胞。表明诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌候选疫苗具有良好的免疫原性,可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答。6.重组植物乳杆菌Lac.VP1可以诱导DCs分化成熟,成熟的DCs可以摄取Lac.VP1迁移到肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴结中作用T淋巴细胞,诱导Th0向Th1类淋巴细胞分化。重组植物乳杆菌Lac.VP1激活了 DCs的TRAF2/NF-κB通路进行了免疫诱导