一、研究背景先天性巨结肠(Hirschsprung disease HSCR)为小儿常见的肠道动力性疾病,总体发病率为1/5000[1],为胚胎期肠神经系统发育异常所致,多基因作用下如在发育中某个或者多个环节出现异常则导致结肠神经化失败,表现为肠段肌间及粘膜下无神经节,故HSCR又称为肠无神经节疾病[2.3]。患儿通常在出生后即出现远端肠梗阻的症状,如不及时治疗,将危及生命。目前除全肠型巨结肠无有效治疗方法外,其他类型巨结肠皆以手术切除病变肠段为主,但许多患者术后仍出现大便失禁,便秘和小肠结肠炎等长期并发症[4.5]。可见HSCR患儿术后的痊愈情况仍需担忧,所以深入研究肠道神经节缺失的发育学基础,发展新的治疗手段,具有十分重要的意义。HSCR为胚胎期肠神经嵴细胞(Enteric neural crest cell,ENCSC)增殖、迁移、分化异常致结肠神经化失败。研究发现,在胚胎发育过程中,ENCSC最早于孕5周出现在发育中的食管,然后由头端开始向尾肠迁移,沿着发育中的肠道迁移,同时伴随着增殖,神经元和神经胶质细胞分化,于孕12周时到达远端结肠,最后神经化结肠形成功能性神经节[6]。动物研究模型表明,许多影响ENCSC增殖、迁移、分化的因子证明和HSCR发生相关,通过大量临床病例测序筛选出散发HSCR患者的致病基因,将参与HSCR发生发展的大多数基因分为三组:(a)涉及RET激活途径[GDNF,GFRαl,PSPN,NTN,RET],(b)涉及EDNRB途径(EDNRB,ECE-1,EDN3)和(c)影响RET/EDNRB途径的转录因子(PHOX2B,ZFXH1B,SOX10)[7]。当然,HSCR是个复杂多基因疾病,只有大约30%的HSCR患者有这些基因的突变[8],仍需要更多研究寻找其他致病基因及其信号途径。Yamakawa et aL.于 1998 年分离出了 Down syndrome cell adhesion molecule(DSCAM)蛋白[9],而DSCAM基因是唐氏综合征相关致病基因,有很多DSCAM基因和中枢神经发育相关性的报道,但研究DSCAM在肠神经发育作用的文章较少。最近资料表明,DSCAM基因在HSCR发病过程中起着重要作用[10,11]。其作用机制主要分为两个方面。第一 DSCAM介导了离子细胞的同性相斥及同类细胞的粘附,并且通过介导同性相斥促进了神经突触的形成。第二介导了轴突的靶向定位。NETRIN-1是重要的轴突定向因子,而近年的研究表明DSCAM即是其除DCC以外的另一个受体,并且在NETRIN-1表达异常的时候还可以和DCC形成单独的通路引领轴突方向[12]。数据显示无论是果蝇还是脊椎动物,DSCAM在发育中的神经系统中都是高表达,预示了其在神经发育中的重要作用,但其具体作用通路仍需要进一步的研究。对于SNP研究的意义,概括地说,人类基因组的多态性对于医学,特别是对于遗传病具有双重意义[14,15]。一方面,基因的有害突变(突变是多态的一种特殊形式),不论是经典的点突变,还是动态突变,本身就可能是遗传病的病因;另一方面,众多的多态性位点又是很好的遗传标记,可以在遗传病的研究和临床诊断中发挥重要作用。所以DSCAM的基因多态性的分析对于研究复杂基因作用的HSCR具有重要意义。众所周知,目前对于人类发育和疾病的研究,特别是疾病相关的分子机制研究均采用动物模型,尤其是遗传修饰的小鼠模型(转基因或基因敲除小鼠模型);但由于动物和人类的种属及基因共线性的巨大差异,决定了它很难完全模拟人类的生理状况并精确地反映人类疾病的发病过程。近年来,iPSCs(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的诞生为我们利用人类模型研究人类疾病提供了有力的工具。iPSCs可由病人的皮肤或者血液诱导形成,可实现自体移植,即携带了病人突变的基因,又比较容易在体外进行基因编辑,并且iPSCs能在体外无限扩增,最终能在体外诱导形成功能性肠神经元,为干细胞治疗应用于临床提供了良好的研究平台。学者Kenneth R.Chien[17]提出,干细胞技术即避免了种属及个体差异,且携带了致病基因,将使利用人类模型取代小鼠模型研究人类发育机制和疾病治疗成为可能。如果建立了携带遗传缺陷基因的诱导多能干细胞系,其诱导分化的细胞将继续携带基因缺陷的特性,因此可以作为疾病细胞模型,在体外模拟疾病的发病过程,从而能够深入研究相关疾病的发病机制;另一方面,诱导分化的有缺陷的靶细胞可以为基因修复治疗、药物筛选、毒理评价提供细胞工具[18,19]。目前还没有携带DSCAM基因缺陷的iPS细胞模型建立的报道。二、研究目的基于以上的背景,本研究首先对样本进行GWAS分析,统计分析DSCAM基因在HSCR中的表达特点,研究其在HSCR发病机制中的作用。继而选择DSCAM基因缺陷病人的皮肤标本,体外建立来源于DSCAM基因缺陷HSCR患者的iPSCs细胞系,鉴定并分析疾病iPSCs细胞,确定其多能性,获取HSCR细胞研究模型。主要研究内容分为以下两部分:研究内容分为以下二个部分:第一部分:DSCAM基因多态性与先天性巨结肠的相关性研究第二部分:DSCAM基因缺陷先天性巨结肠iPSCS模型的建立及生物学特性分析三.研究方法与结果:第一部分:DSCAM基因多态性与先天性巨结肠的相关性研究1.1目的通过GWAS分析DSCAM的基因多态性与先天性巨结肠HSCR之间的关系,为研究先天性巨结肠的发病机制提供线索,同时为疾病的预防和治疗提供新的思路。1.2方法:1.收集2000年1月至2015年12月在广州市妇女儿童医疗中心诊治并且术后病理证实为先天性巨结肠患儿病变组织的石蜡标本,共1470例,均为散发性。同时收集在广州市妇女儿童医疗中心中心正常体检或排除先天性消化道畸形的儿童1473例作为健康对照组,取其检验剩余静脉血3ml。本研究获得了广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会同意,符合中华伦理学委员会制定的伦理标准,病例组及对照组均获得其监护人知情同意。石蜡标本组织和静脉血均提取DNA,保存至-80℃备用。查阅相关文献及生物库信息数据库查找DSCAM基因的多态(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),选取DSCAM基因的 2 个 SNPs,应用PCR扩增目的基因、直接测序的方法对2个SNPs进行分析。1.3结果:1)疾病关联分析:在HSCR组与对照组之间,DSCAM基因的2个SNPs rs2837770 and rs8134673等位基因频率分布有统计学差异(P<0.05);2)关联性分析:经过r2模式下、logistic回归分析之后,2个SNPs相互作用关联性强,单倍型分析中,G-G类型更易较其他组合致HSCR风险更高,且两者协同作用.3)临床关联性:比较其他亚型的HSCR,两种SNPs和S-HSCR发病相关性更高,1.4 结论:DSCAM 的两个 SNP rs2837770 and rs8134673 增加了 HSCR 的基因易感性,两周之间相互作用并可协同增加HSCR易感性,且两者和S-HSCR发病相关性高。第二部分:DSCAM基因缺陷先天性巨结肠IPSCS模型的建立及生物学特性分析2.1目的在获得单位医学伦理道德委员会的批准和病人的知情同意后,筛查临床样本,确定有DSCAM基因缺陷病例,从患者皮肤标本中分离培养成纤维细胞,体外诱导培养出HSCR-iPSCs,建立体外HSCR细胞研究模型。2.2方法2.2.1外科手术的过程中,取皮肤活检的方法获得了 HSCR病人的小块皮肤组织,用胶原酶消化后用高糖DMEM完全培养基进行培养,约2-3天换液一次,长满后传代。获得的成纤维细胞在P1-P3代进行hiPSCs的建系。2.2.2同时留取病人血液行基因测序,检测DSCAM基因突变情况2.2.3慢病毒包装和感染皮肤成纤维细胞利用 X-tremeGENE HP,将 PMX-Oct4,Sox2,C-Myc,Klf4 与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,包装成慢病毒。感染前一天将按3×10 4/HSCR-2接种HSCR皮肤成纤维细胞,一天后加入病毒上清。感染完一两天后传代至饲养层细胞接种后的7-14天,观察到饲养层细胞上出现较多类似人胚胎干细胞样的克隆,用机械传代的方法培养扩增。2.2.4稳定表达hrGFP的的HSCR-hiPSCs和和con-hiPSCs细胞系的建立利用X-tremeGENE HP,将hrGFP的表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,包装成病毒。感染前一天hiPSCs细胞用EDTA消化后种至六孔板中,次日加入病毒上清感染hiPSCs,持续观察5-7天,然后在培养液中加入puromycin,持续筛选2周左右,获得稳定表达hrGFP的HSCR-hiPSCs和con-hiPSCs,以备后续的共培养和体内移植实验。2.2.5 应用免疫荧光染色的方法检测 Oct4,Nanog,SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等的表达情况。②利用RT-PCR的方法,检测Nanog、Rex-1和内外源性的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等基因的表达。③利用组织化学的方法检测碱性磷酸酶的表达情况;④在低粘附性的培养皿悬浮培养,使HSCR-hiPSCs形成球状的拟胚体,在分化8天后进行免疫组化和RT-PCR检测,分析Oct4、Tuj1、aSMA和Sox17等基因的表达变化;⑤取一小瓶生长旺盛的细胞(>1×10 6个),用秋水仙碱处理2h,然后将细胞消化成当个细胞,离心收集后进行核型分析。⑥取一孔细胞,提取基因组DNA,送测序,检测基因组DNA突变情况。⑦取5×106的细胞注射到裸鼠腹股沟皮下,连续观察两个月,然后取出肿瘤组织,石蜡包埋和切片,进行病理分析,观察三胚层组织是否形成。2.3结果:2.3.1 成功建立了 DSCAM基因缺陷-先天性巨结肠病人及正常人对照组成纤维细胞系。2.3.2 收集pUMVC,VSV-G和GFP共感染293FT细胞后的上清液,感染HSCR病人及正常人皮肤成纤维细胞。发现逆转录病毒感染后,细胞表达外源基因的阳性率在70%以上,并可在3周内持续表达。2.3.3免疫荧光染色和RT-PCR对诱导得到的细胞进行基因检测,发现正常人hiPSCs和hHSCR-hiPSCs细胞系符合人类胚胎干细胞的特征。并且通过体外自然分化可以得到三胚层样的细胞。将其注射于裸鼠皮下,三个月后处死小鼠,可见畸胎瘤形成,取畸胎瘤做石蜡切片和HE染色,发现有三胚层样结构形成。2.4结论:成功建立了逆转录病毒法制备成含DSCAM基因缺陷HSCR病人iPSCs体系,该细胞系可进行体外扩增、冻存和复苏,可以保持正常核型。同时,观察发现该细胞系表达胚胎干细胞标记物并具有三胚层分化潜能。四、讨论1.通过GWAS技术对HSCR临床样本进行统计分析,研究DSCAM在HSCR发病机制中的作用HSCR的病因研究是全球的一个非常活跃的研究领域。我们收集了 1470例患者和1473例对照的中国南方人群血液样本,并成功复制了两个单核苷酸多态性对HSCR,特别是对短段型患者的发病影响。这两个SNP增加疾病风险之间存在着明显的协同作用;在无神经节段与神经节段与正常对照组比较分析中我们还观察到一个明显的低表达差异,当然,潜在的机制仍不清楚。另一方面,我们可以推测可能存在DSCAM罕见突变可以加重HSCR表型。目标区域测序是将进一步定位疾病的因果变化的一种有效方法,这将大大解释了 HSCR的遗传缺失。另一方面,我们证明了这两种相关的SNPs在DSCAM可能之间的片段性,当然也部分解释了 HSCR的遗传缺失。其实,这不是基因/基因上位性之间的共同变异被确定为HSCR或其他复杂疾病相关的第一次。Gui[22]等人证明了变异的相互作用,如RET和NRG1的多态性增加了 HSCR患病的风险。目前的研究表明,基因互相作用的遗传变异增加了疾病罹患风险。当然我们仍然需要进一步的实验研究DSCAM引起HSCR的发病机制。2.DSCAM-/--iPSCs细胞模型的成功建立,为通过细胞模型模拟先天性巨结肠病理发展提供了研究基础。我们采用Yamanaka逆转录病毒四基因法建立了正常人和HSCR病人成纤维细胞来源的iPSCs细胞系[23]。通过留取HSCR病人皮肤成体细胞标本,培养出成纤维细胞,逆转录病毒过表达外源基因以及通过ES细胞条件培养,最终得到了 HSCR-iPSCs细胞。进一步的研究结果显示得到的HSCR-iPSCs细胞均呈克隆样生长,传代过程中保持正常核型、表达ES细胞标志、多能性相关基因甲基化异于成体细胞,并可在体外和体内分化出三胚层来源的细胞或组织,保持致瘤性。之所以我们首先明确患者疾病基因特点,是因为一旦明确患者疾病标本的基因特点,我们就可以对标本进行针对性基因修复,然后在模拟疾病的过程中,就可以看到是否存在细胞功能的恢复,为疾病的临床治疗方案提供精准治疗。如AngedRaya[24]等将范式贫血患者的真皮成纤维细胞用慢病毒进行基因修饰,然后用逆转录的方法诱导分化为iPSCs细胞,证明了范式贫血iPSCs细胞具有体外成血细胞的能力,但并l发现范式贫血相关遗传特征。还有Gabsang Lee[25]等培养了家族性自主神经异常(FD)患者的成纤维细胞,诱导形成FD-iPSCs细胞。通过对比FD-iPSCs细胞和正常细胞来源iPSCs细胞的分化过程,而解释了疾病的部分发生机理,并且通过在iPSCs细胞模型上的实验发现药物可在改善分化后细胞的病理症状。AllisonD.Ebert[26]等取I型SMA病人的成纤维细胞,通过慢病毒的方法诱导得到iPSCs细胞,并且检测了 iPSCs细胞的分化潜能,发现疾病模型iPSCs细胞和正常iPSCs细胞分化成运动神经元的能力相同,效率相当。此外他们又利用此细胞模型验证了丙戊酸和妥布霉素对SMN基因表达蛋白的作用,发现SMA-iPSCs细胞经药物作用后,SMN蛋白表达明显增强。这些研究表明利用iPSCs细胞模型获得的人类疾病特异的细胞模型为HSCR疾病的发病机制研究以及疾病个体化治疗中具有巨大的优势。目前尚无DSCAM-/--HSCR特异性iPSCs细胞模型建立的研究报道。