背景胃癌是常见的恶性肿瘤,在所有肿瘤引起的死亡原因中占第三位,严重危害全球人们的生命和健康。我国是胃癌高发的国家,胃癌的发病率、死亡率居我国所有恶性肿瘤第二位。临床大数据显示,40%以上的胃癌患者都会发生转移,其5年生存率仅为30%,转移是造成胃癌患者死亡的主要原因。然而,目前胃癌转移的生物学及分子机制尚不明确,转移的胃癌缺乏有效的诊治方法。因此,本论文深入探讨胃癌转移的分子机制具有重要的意义。细胞外基质蛋白1(extracellular matrix protein 1,ECM1)是一种分泌型糖蛋白,可以刺激内皮细胞增殖、促进血管形成。ECM1在肝癌、浸润性乳腺导管癌、喉癌、胆管癌等恶性肿瘤中呈高表达,且研究表明,ECM1在某些恶性肿瘤的转移中起着促癌基因的作用,影响患者的预后。最近,有数据显示,ECM1在伴有淋巴结转移的胃癌组织中的表达量显著高于癌旁组织及淋巴结未转移的胃癌组织,提示ECM1与胃组织中腺上皮细胞的癌变及淋巴结转移有关。此外,胃癌组织中ECM1表达量与血管内皮生长因子VEGF的表达量有显著相关性。这些研究均提示ECM1参与胃癌转移过程,但ECM1在胃癌转移过程中的具体作用及其机制尚不清楚。本论文拟深入探讨ECM1在胃癌转移中的作用及机制,为胃癌的临床诊治提供新的治疗方案。有研究发现,miRNA-92a在乳腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达异常,在胃癌组织中低表达,且与胃癌分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关,与胃癌临床预后呈负相关。本研究利用Targetscan和PicTar数据库,预测miRNA结合位点,我们发现在ECM1基因中存在着miRNA-92a可能的结合位点,提示ECM1可能是miRNA-92a的潜在靶基因。然而,miRNA-92a在胃癌中的功能以及调节ECM1表达的分子机制,至今尚不清楚。本研究在胃癌中系统研究了 ECM1基因与miRNA-92a的调控关系,为胃癌的治疗提供新的靶点。研究目的:本论文主要研究:(1)明确ECM1在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异,及ECM1表达量与临床病理参数的相关性;(2)阐明ECM1表达对胃癌细胞转移的影响;(3)揭示miRNA-92a调控ECM1对胃癌转移的影响与机制。研究方法:(1)首先,从癌症基因组图谱数据库(TCGA)和Kaplan Meier-plotter在线数据库检索ECM1基因表达信息及总生存期的数据,分析ECM1表达情况与患者生存期的关系;其次,利用免疫组化方法检测胃癌组织和癌旁组织中ECM1表达水平,进一步确定ECM1在胃癌中的表达变化以及与胃癌患者临床病理参数之间的关系。(2)通过慢病毒载体构建ECM1过表达和干扰胃癌细胞株,分别运用transwell检测、划痕愈合实验、抗失巢凋亡检测、克隆形成实验、粘附实验和裸鼠腹腔成瘤模型,研究ECM1过表达和敲低后对胃癌细胞体外、体内生物学表型的影响。(3)通过生物信息学软件分析预测,ECM1基因3’UTR区域可能存在miRNA-92a的结合位点,构建ECM1-3’UTR报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因和定点突变技术检测验证miRNA-92a在ECM1基因上的结合位点和对ECM1表达的调控。研究结果:(1)从TCGA和Kaplan Meier-plotter数据库搜索到,胃癌组织及正常组织中含有ECM1基因表达信息的数据,发现ECM1在胃癌中高表达,并且高表达ECM1的胃癌患者较低表达ECM1患者总生存率显著下降。通过对中国科技大学附属第一医院病理科收集的胃癌组织进行检测,结果发现胃癌组织中ECM1的表达水平显著高于癌旁组织,进一步证实ECM1在胃癌中高表达。此外,ECM1的表达与胃癌组织大小(p=0.013)、TNM分期(p=0.039)和淋巴浸润(p=0.006)存在显著的正相关,高表达ECM1组的预后显著差于低表达组(p=0.019)。表明ECM1与胃癌生长、转移呈正相关,与生存期和预后呈负相关。(2)建立高表达ECM1的BGC-823胃癌细胞株和低表达ECM1的MGC-803胃癌细胞株及其对照细胞株。我们发现与对照组细胞株相比,在高表达ECM1的BGC-823细胞中,ECM1蛋白和mRNA的表达水平显著升高,划痕愈合能力明显增强,侵袭能力增强,抗失巢凋亡胃癌细胞的百分比显著上升,胃癌细胞与细胞外基质的粘附能力增强,非锚定依赖性生长能力增强。同时,EMT相关标志物Vimentin和Snail蛋白的表达量明显增加,E-Cadherin的蛋白表达水平显著下降。体内实验结果显示,过表达ECM1裸鼠的腹部肿瘤结节数量和腹水体积显著增多,ECM1过表达显著降低了荷瘤裸鼠的总存活率。然而,在稳定干扰ECM1表达的MGC-803细胞株中ECM1蛋白和mRNA的表达水平、划痕愈合能力、肿瘤细胞的侵袭能力、抗失巢凋亡胃癌细胞的百分比、与细胞外基质的粘附能力、非锚定依赖性生长能力都显著下降,荷瘤裸鼠的腹部肿瘤结节数量和腹水体积显著减少,裸鼠的总存活率显著升高。(3)基于生物信息学软件分析,我们发现在ECM1基因3’UTR区域存在miRNA-92a的结合位点,并且转染miRNA-92a的胃癌细胞ECM1的表达量降低,双荧光素酶实验证实miRNA-92a对ECM1具有调控作用。转染miRNA-92a后胃癌细胞的抗失巢凋亡能力、matrigel胶粘附能力和迁移能力较对照组显著下降,而转染ECM1后可以显著抑制miRNA-92a对胃癌细胞的抗失巢凋亡、matrigel胶粘附及迁移的抑制作用。研究结论本论文的实验结果证明ECM1在胃癌组织中高表达,且其表达水平与胃癌肿瘤进展呈正相关,而与胃癌患者预后呈负相关。ECM1能够通过调控胃癌细胞中EMT相关蛋白(Vimentin、Snail、E-Cadherin)的表达来增强细胞转移能力;此外,本研究揭示了 miRNA-92a通过靶向ECM1基因3’UTR 区来负调控ECM1的表达,而抑制胃癌细胞的转移。本论文阐明了 ECM1在胃癌转移中的重要作用,并且明确了 miRNA-92a通过调控ECM1表达而抑制胃癌细胞转移的分子机制,为胃癌的诊疗提供了新的研究靶点和通路。