青蒿植物内生放线菌的分离和多样性研究

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植物内生放线菌存在于各种植物中,研究发现植物内生放线菌中蕴藏着大量活性菌株,是开发抗菌等活性物质的重要来源。有些植物内生菌具有产生与宿主相同或相似的活性物质的能力。植物内生放线菌是一个尚待开发的新领域,它们所产生的活性物质往往具有新颖性,可能具有很好的应用特性。利用植物内生放线菌发现高效、新颖、低毒的新活性物质潜力巨大,在医药、农业和工业生产等领域展现出良好的应用前景。   本研究以青蒿植物为材料,分离青蒿植物内生放线菌,并在菌株鉴定的基础上,对其抗肿瘤活性、抗菌活性等进行评价,为青蒿植物内生放线菌资源的开发和利用提供了实验依据。   通过使用次氯酸钠、乙醇对青蒿植物样品进行表面消毒,选用TWYE、HV和高氏1号等多种培养基,采用重铬酸钾、制霉菌素、萘啶酮酸、利福平等抗生素等对青蒿植物内生放线菌进行选择性分离。从云南西双版纳、昆明、大理等地采集的青蒿植物样品中,分离得到273株植物内生放线菌。通过多样性研究发现,在不同来源的青蒿植物中的内生放线菌类群分布存在较大差异。   对分离得到的273株植物内生放线菌通过菌落形态和16S rRNA基因序列分析,鉴定到属一级的水平。分离到的273株植物内生放线菌可分为11个属,分别是链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、小单孢菌属(Micromonospora)、韩国生工菌属(Kribbella)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、球孢囊菌属(Sphaerisporangium)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、野野村菌属(Nonomuraea)、戈登氏菌属(Gordonia)。结果表明,链霉菌在所有青蒿植物样品中普遍存在,且数量上占绝对优势,假诺卡氏菌属和小单孢菌属是除链霉菌外两个较为优势的类群。   利用MTT法和琼脂扩散法对所分离到的部分青蒿植物内生放线菌进行体外细胞毒活性和抗菌活性检测,共有32株菌显示对肺腺癌细胞(A549)有抗肿瘤活性,占检测菌株数的32%;有31株菌显示对肾癌细胞(ACHN)有细胞毒活性,占检测菌株数的31%。筛选到具有较高抗菌活性的内生放线菌48株,占检测菌株数的24%。   采用多相分类研究方法,对菌株YIM63135进行了形态特征、细胞化学组分、16S rRNA基因序列分析及其基因组DNA-DNA同源性测定等研究,结果表明菌株YIM63135为链霉菌属(Streptomyces)的1个新种,命名为青蒿链霉菌(Streptomyces artemisiae sp.nov.)。   将分离得到的内生放线菌菌株分别进行发酵,提取菌株代谢产物,利用TLC,HPLC等方法对菌株的代谢产物进行研究,得到一株具有产生青蒿素或类似物能力的内生放线菌YIM63342,并对菌株YIM63342进行鉴定及后续的化学分离纯化研究。   研究结果证实青蒿植物内生放线菌作为一种新颖的微生物资源,具有巨大的研究开发潜力。
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