抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药scFab抗体的制备及其特性分析

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二乙氧基硫代磷酸酯类(DPPs)有机磷农药是一类具有硫代磷酸二乙酯官能团的有机磷农药,曾广泛应用于农业中。误用或滥用DPPs类农药往往导致环境、食品及药品的污染,甚至造成生物和人类的中毒或死亡。因此,迫切需要监测DPPs类农药在农产品及环境中的残留。免疫检测分析是近年来小分子有毒有害物检测领域的研究热点,而基因工程抗体的构建是获取免疫分析方法核心原材料的新途径。目前,研究较多的重组抗体包括单链抗体scFv和Fab抗体,这两种抗体各有优缺点,其中scFv相比Fab抗体的稳定差,而Fab表达效率低于scFv。鉴于此,本研究通过制备一种新型的抗DPPs单链Fab抗体,即scFab,对其特性进行分析,期望获得同时具备高表达效率及高稳定性的重组抗体。具体研究工作及结果如下:(1)两种抗DPPs scFab表达载体的构建与表达设计引物,以前期获得的抗DPPs的Fab抗体基因为模板,分别扩增出两套抗体κ链、Fd段基因。第一套κ链和Fd段基因,其5’端和3’端分别插入Sac I和Xba I、Xho I和Spe I限制性酶切位点,第二套κ链和Fd段基因,其5’端和3’端分别插入Xho I和Spe I、Sac I和Xba I限制性酶切位点,得到的Fd段基因大小约670 bp,κ链基因大小约为650 bp,与预期相符。将Fd段与κ链基因插入到经酶切的pComb3XSS载体,转入大肠杆菌E.coli TOP10F?,重组质粒经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,最终成功构建了两种重、轻链顺序不同的抗DPPs scFab表达载体pComb3XSS-DPPs-scFab-Fd-κ、pComb3XSS-DPPs-scFab-κ-Fd。挑取阳性克隆,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和western blotting鉴定。SDS-PAGE电泳结果表明,目的蛋白的相对分子质量约为50 kDa,大小与预期结果一致。Western-Blotting分析显示,目的蛋白带能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,表明重、轻链顺序不同的scFab-Fd-κ和scFab-κ-Fd两种抗体蛋白表达成功。(2)抗DPPs scFab的活性鉴定利用icELISA对表达制备的scFab-κ-Fd和scFab-Fd-κ进行活性鉴定。结果显示:scFab-κ-Fd对蝇毒磷和对硫磷两种药物IC50值分别为1.5 ng/mL和3.1 ng/mL,scFab-Fd-κ对两种药物的IC50同前分别为3.7μg/mL和8.5μg/mL。另外12种农药的抑制实验显示,即使药物浓度达到1 mg/mL,scFab-Fd-κ也没有明显的抑制现象,而scFab-κ-Fd则表现较好的活性。(3)抗DPPs scFab特性分析取相同表达条件下的scFab-κ-Fd、scFv及Fab周质腔提取物进行抗体表达水平、特异性及稳定性分析。Western-Blotting分析显示:Fab重组菌诱导表达周质腔提取物浓缩4倍,可见一条约23 kDa的条带。scFv和scFab-κ-Fd重组菌诱导表达周质腔提取物,不经浓缩,分别在25 kDa和50 kDa显示清晰的条带。周质腔提取物初始效价的比较显示:scFab能够结合包被原的浓度与scFv相似,但高于Fab。说明在周质腔提取物中,scFab表达水平与scFv的相似,Fab较低。icELISA结果显示:scFab抗体的灵敏度与scFv相比略低,与Fab的一致。稳定性分析结果显示:在孵育过程中,抗体包被原结合活性下降的幅度为Fab<scFab<scFv;灵敏度变化幅度:Fab与scFab较一致,而scFv灵敏度下降幅度较大。说明scFab和Fab比scFv稳定。(4)基于抗DPPs scFab的icELISA用于实际样品检测取生菜、黄瓜及白菜为蔬菜样品,经QuEChERS前处理净化后,选择4种代表性二乙氧基硫代磷酸类有机磷农药(对硫磷、除线磷、辛硫磷和喹硫磷)进行添加回收实验。结果表明:白菜、黄瓜以及生菜样品中DPPs有机磷农药平均回收率分别在81.2~121.8%、90.8~116.1%和82.7~123.4%之间;平均变异系数在6.8~20.1%之间。将上述样品同时进行仪器检测对比,结果显示相关系数为0.9887,说明基于scFab所建立的icELISA具有良好的准确性及重复性。
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