Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉中IL-6/JAK2/STAT3信号通路的调控作用及机制

来源 :承德医学院 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zgm_19780916
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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心血管系统中最为常见的疾病,已成为人类死亡的头号杀手。因此,关于AS发病机制研究和抗AS药物的研发越来越备受关注。随着生命科学的迅速发展,近年来在AS进展的各阶段均检测到炎症相关因子的大量表达,如C反应蛋白、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等,由此说明,AS的发生发展过程中免疫炎症反应发挥着不可替代的促进作用。IL-6是AS的致炎因子,促进斑块的发展,参与AS的形成。IL-6与其受体结合后,可激活与炎症调控密切相关的酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活因子(Janus kinases/signal transducer and activator of transcriptions,JAK-STAT)信号通路,从而影响炎症因子间的相互作用、增强炎症反应级联,继而成为致AS的关键病理环节。大量研究发现,IL-6/JAK2/STAT3信号通路激活后可引起血管内皮细胞功能失调、血管平滑肌细胞迁移和增殖、炎症细胞增殖分化和迁移以及促炎症细胞因子的过度表达等AS病理改变,促进AS发生发展。因此,抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路激活或可有效地缓解AS的病理变化,为抗AS药物的研发提供重要的实验依据。尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)是已知作用最强的缩血管活性物质,与其特异性受体G蛋白偶联受体14(G protein coupled receptor,GPR14)构成的UⅡ/UT系统,在促进AS进程中发挥着显著作用。Urantide是在UⅡ的基础上衍生而来的UⅡ受体拮抗剂,可有效地抑制UⅡ/UT系统,使其丧失生物学功能。前期研究发现,UⅡ与其受体GPR14的结合可激活IL-6/JAK2/STAT3信号通路,通过炎症机制参与AS的发生发展;而urantide则可阻断UⅡ/UT系统进而抑制该通路的激活,缓解AS的进展过程,但具体作用机制尚不清楚。因此,本文以AS大鼠为研究对象,研究urantide对IL-6/JAK2/STAT3信号通路的调控作用及机制,探讨urantide与该信号通路激活的上下游信号通路蛋白及炎症介质之间的关系,旨在阐明urantide的抗AS作用靶点与抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路蛋白级联相关,为将其开发成针对IL-6/JAK2/STAT3通路异常激活的抗AS新型靶向治疗药物提供可靠的实验依据。目的:探讨urantide对AS大鼠胸主动脉中IL-6/JAK2/STAT3信号通路的作用及其机制,为防治AS提供新的治疗作用靶点。方法:1.通过高脂饮食联合腹腔注射维生素D3(VD3)的方法建立AS大鼠模型,并按照随机化原则将大鼠分为:正常对照组和模型组;待模型组制备成功后再次按照随机化原则将AS大鼠分为:AS模型组、辛伐他汀组、urantide 3 d组、urantide 7 d组和urantide 14 d组,每组30只大鼠;2.全自动生化分析仪检测正常对照组和模型组大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和钙离子(Ca2+)水平,并计算AS指数;3.苏木素-伊红(HE)染色观察各组间大鼠胸主动脉的形态学变化;4.免疫荧光染色法检测各组大鼠胸主动脉中IL-6、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量及定位;5.实时荧光定量PCR法(RT-q PCR)检测各组大鼠胸主动脉中IL-6、JAK2和STAT3的m RNA表达水平;6.蛋白印迹法(Western blotting)检测各组大鼠胸主动脉中UⅡ、GPR14、IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达水平;7.采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计学分析,以均值±标准差(Mean±SD)表示。两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.模型制备结果显示:与正常对照组比较,模型组大鼠的血清中TC、TG、LDL和Ca2+水平显著升高(P<0.01),HDL水平显著降低(P<0.01),AS指数显著升高(P<0.01);同时,模型组大鼠胸主动脉中内膜隆起,中膜平滑肌细胞排列紊乱、弹力纤维层断裂,出现泡沫细胞、钙化组织和纤维帽以及中央坏死物质等典型的AS病理变化。2.HE染色结果显示:AS模型组大鼠胸主动脉中发生了内膜破裂、钙化组织、粥样斑块内大量的中央坏死物质以及胆固醇结晶间隙等更加显著的AS病变;与AS模型组相比,urantide各实验组AS大鼠的胸主动脉病变程度明显缓解,且具有时间依赖性。3.免疫荧光染色结果显示:正常对照组大鼠胸主动脉中IL-6、p-JAK2和p-STAT3蛋白少量表达;与正常对照组比较,AS模型组大鼠胸主动脉中IL-6、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达增多,IL-6、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达于粥样斑块及周围组织中,且表达较其他部位明显增多。Urantide各实验组与AS模型组相比,各实验组大鼠胸主动脉中IL-6、p-JAK2和p-STAT3表达呈下降趋势。4.RT-q PCR结果显示:与正常对照组相比,AS模型组大鼠胸主动脉中IL-6、JAK2和STAT3的m RNA表达水平显著升高(P<0.01);与AS模型组相比,urantide各实验组IL-6、JAK2和STAT3的m RNA表达水平呈明显的下调趋势(P<0.01)。5.Western blotting结果显示:与正常对照组相比,AS模型组大鼠胸主动脉中UⅡ、GPR14、IL-6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3蛋白均明显升高(P<0.01);与AS模型组相比,urantide各实验组UⅡ、GPR14、IL-6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达显著降低(P<0.01),UⅡ、GPR14和IL-6蛋白具有显著的下调趋势,而p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达以给药7 d效果为佳。结论:多肽类化合物urantide可有效降低AS大鼠胸主动脉中UⅡ和GPR14蛋白表达,下调IL-6/JAK2/STAT3信号通路相关的m RNA和蛋白表达水平。由此,本研究初步得出结论urantide拮抗UⅡ/UT系统后,抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路的激活状态,从而改善AS大鼠的病理变化。
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