【摘 要】
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目的:全球RA总体发病率约为1%,患者群体规模非常庞大。现有常规RA治疗药物虽能缓解症状,但不能遏制疾病进程,且毒副作用明显。蝉翼藤是我国南方地区常见的主要用于RA治疗的少数民族传统植物药。本团队前期研究表明,其主要活性成分能有效地抑制体内外炎症,并对多种体内关节炎模型具有可靠治疗作用。有鉴于此,我们制备了活性组分。本研究首先基于炎性巨噬细胞模型确定活性组分中关键性成分构成与药理活性特点,进一步分
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目的:全球RA总体发病率约为1%,患者群体规模非常庞大。现有常规RA治疗药物虽能缓解症状,但不能遏制疾病进程,且毒副作用明显。蝉翼藤是我国南方地区常见的主要用于RA治疗的少数民族传统植物药。本团队前期研究表明,其主要活性成分能有效地抑制体内外炎症,并对多种体内关节炎模型具有可靠治疗作用。有鉴于此,我们制备了活性组分。本研究首先基于炎性巨噬细胞模型确定活性组分中关键性成分构成与药理活性特点,进一步分析固有免疫与能量代谢应答干预对蝉翼藤体内抗风湿活性的积极意义。方法:1.在细胞层面遴选巨噬细胞靶向性活性成分:利用WB技术分析XRF对LPS预刺激RAW264.7细胞内主要炎症通路的影响,并根据活细胞靶向吸附分析策略,初步确定XRF中TLR4高亲和力活性成分;进一步利用分子模拟,细胞热转移分析,免疫共沉淀,ELISA,双荧光素酶报告基因和免疫荧光等技术手段论证特定结构芳香族衍生物具备靶向TLR4抑制作用,是蝉翼藤阻断巨噬细胞介导炎症反应的重要物质基础。2.在动物层面阐明蝉翼藤活性成分干预免疫-代谢反馈的初步机制及其对RA治疗活性的影响:建立CIA模型,予以MTX（0.33mg/kg）及XRF-SU或XRFME治疗（剂量均为50mg/kg）。此后持续观察CIA进展,并于28天后处死大鼠。基于足爪形态学及HE/SOFG染色组织切片观察,初步确定XRF对CIA治疗活性的特点;进而采用表达谱芯片技术,遴选治疗涉及的靶点与通路,以免疫组化、ELISA、WB、LC-MS等方法对所得结果进行验证。在共培养体系,进一步利用QPCR,ELISA,WB等方法分析不同病生理条件大鼠来源巨噬细胞与脂肪细胞的应答作用,检测代表性活性化合物XAN对上述反馈过程的影响,及由此引发的治疗意义。结果:1.XRF可抑制LPS预刺激RAW264.7细胞内TLR4/NF-κB通路的激活。2.XRF中代表性成分XAN可靶向结合RAW264.7细胞表面受体TLR4,抑制后者二聚化。3.XAN可以缓解LPS刺激诱发的巨噬细胞TNF-α和IL-1β大量分泌,减少细胞核内p-p65的积累,抑制NF-κB的转录活性。4.XRF治疗能降低CIA大鼠血液中TNF-α、IL-1β和IL-17α浓度,抑制关节内JNK和NF-κB通路激动,阻断巨噬细胞M1型极化。相对于MTX,其关节保护作用更为突出。5.基因芯片分析提示,XRF能够显著上调以胶原为代表的胞外基质相关基因的表达,对免疫相关基因及RA通路总体产生恢复性调控作用,同时该治疗对PPAR家族具有深远影响。6.代谢组学分析表明,XRF治疗降低了脂肪酸的生物合成水平,并抑制了二型胶原的降解。7.体外实验中,XAN上调巨噬细胞PPAR-γ的表达;抑制前脂肪细胞PPAR-γ表达,减少脂联素分泌和SCD-1蛋白表达。SIRT1表达呈现同步的反向调控趋势。XAN对滑膜细胞中MMP3表达的负面作用在巨噬细胞-前脂肪细胞共培养系统中得以进一步加强。结论:1.蝉翼藤中以XAN为代表的活性成分可选择性通过与巨噬细胞上TLR4直接结合,抑制TLR4/NF-κB的激活及随后的促炎细胞因子过量分泌,进而缓解关节及其他部位的局部炎症,避免固有免疫系统的异常过度兴奋及免疫稳态破坏。2.上述物质对脂肪与免疫系统中PPAR-γ通路具有差异化调控功能,通过兴奋巨噬细胞内PPAR-γ同时抑制脂肪细胞内PPAR-γ,产生持续的抗炎及抗脂质蓄积活性,消除或弱化FLSs产生的侵蚀性病理性改变的外部环境,改善RA/CIA条件下的关节损伤。
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