研究背景及目的结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是目前全球的第三大癌症死因,也是全球范围内因癌症死亡的主要原因之一。结直肠癌发病隐匿,多数确诊时已为晚期。结直肠癌患者死亡主要是由于转移发生,超过70%的患者会出现肝脏转移,肝转移是影响结直肠癌预后差的重要因素。阐释结直肠癌肝转移发生和发展的分子机制,探寻结直肠癌肝转移早期诊断标志物及有效的治疗靶点,是降低结直肠癌死亡率的关键。本研究中,通过microRNA微阵列芯片高通量筛选正常组织-腺瘤-结直肠癌发生和发展相关的差异miRNA,并通过进一步扩大样本量,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证并建立结直肠癌miRNA差异表达谱,筛选出在正常组织-腺瘤-结直肠癌中表达逐渐增加的miR-135a-5p进行后续的功能研究。结合结直肠癌患者及细胞外泌体分析,识别及验证外泌体miR-135a-5p调控的下游靶基因及相关信号通路,初步探讨外泌体穿梭miR-135a-5p在结直肠癌肝转移微环境中的作用机制,并进一步评价其作为结直肠癌诊断及预后标志物的诊断价值,为阐明结直肠癌肝转移的发病机理、发现早期诊断标志物及以miR-135a-5p为潜在干预靶点的个体化靶向治疗提供新的依据及策略。研究方法1.结直肠癌组织microRNA差异表达谱分析1.1招募经病理诊断确诊的来自不同样本的192例结直肠癌病人及192例腺瘤病人,所有患者术前均未经过放化疗治疗。所有结直肠腺瘤患者收集腺瘤组织。送检3例结肠癌患者组织样本(癌组织和癌旁组织),3例直肠癌患者组织样本(癌组织和癌旁组织),6例腺瘤患者组织样本。应用miRNA芯片筛选出在癌旁-腺瘤-癌组织中表达呈逐渐增加的miR-135a-5p做进一步的研究。采用qRT-PCR技术进一步在大样本中验证miR-135a-5p的表达水平。并采用ROC曲线评估组织中miR-135a-5p表达水平对于辅助诊断结直肠癌的效力。1.2应用组织芯片及原位杂交技术在已建立的具有10年随访资料的1078例结直肠癌患者组织芯片(也称组织微阵列,tissue microarrays,TMA)样本中进行miR-135a-5p的表达水平检测。多因素Cox回归分析对影响结直肠癌患者生存时间的因素(年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分级、TNM分期及miR-135a-5p表达水平)进行风险评估,进一步研究miR-135a-5p表达与结直肠癌患者发病风险及转移的关系。2.miR-135a-5p对结直肠癌转移的影响2.1利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建miR-135a-5p敲除的结直肠癌细胞,应用RNA原位杂交技术检测结直肠癌细胞中miR-135a-5p表达及肿瘤微环境缺氧对miR-135a-5p表达的影响。利用Transwell实验研究miR-135a-5p敲除后对结直肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响。2.2将miR-135a-5p mimics转染结直肠癌细胞SW620,在构建裸鼠荷瘤模型中研究miR-135a-5p敲除及过表达对结直肠癌生长的影响。将构建的荧光素酶慢病毒感染SW620(野生型、miR-135a-5p KO)经尾静脉注射入裸鼠体内,酶标仪检测裸鼠荷瘤模型中的肿瘤、肝脏及肺组织组织匀浆的荧光强度,分析miR-135a-5p对结直肠癌细胞转移的影响。3.外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响及机制研究3.1利用差速离心法分离结直肠癌患者和健康对照人群血清中以及结直肠癌细胞SW620培养上清中的白色沉淀,通过透射电镜观察外泌体的形态。分析结直肠癌患者来源的血清中外泌体的数量与健康对照人群的差异及肿瘤微环境缺氧对结直肠癌细胞中外泌体分泌的影响。实时荧光定量qRT-PCR法检测外泌体中miR-135a-5p的表达,通过对结直肠癌样本进行分层分析探索结直肠癌患者外泌体中miR-135a-5p的表达水平与结直肠癌肝转移的相关性。构建Pre-niche(转移前微生态环境)肝转移小鼠模型,通过免疫荧光染色法对小鼠肝脏组织的外泌体表面标记分子(PKH26)及肝脏巨噬细胞(Kupffer细胞)表面标记分子(F4-80)进行检测。3.2构建Pre-niche肝转移小鼠模型,利用H&E染色分析血清中外泌体以及缺氧诱导的结直肠癌细胞上清外泌体中miR-135a-5p对小鼠肝组织的影响。3.3将SW620(WT,miR-135a-5p KO)细胞上清中的外泌体与人肝组织细胞共培养,利用转录组高通量测序技术分析miR-135a-5p作用在肝组织细胞上的下游靶基因,生物信息学分析筛选出淋巴细胞活化抗原CD30基因的3’UTR序列潜在性与miR-135a-5p结合,通过构建荧光素酶报告基因验证CD30与miR-135a-5p的结合作用。利用实时荧光定量qRT-PCR和Western blot法分别检测外泌体miR-135a-5p对CD30的mRNA和蛋白分子水平上的调控作用以及外泌体miR-135a-5p对CD30下游通路中免疫调控相关基因TNF受体关联因子2(TRAF2)、细胞核因子p65、人肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-2(IL-2)的表达调控。3.4利用生物信息学分析预测miR-135a-5p下游靶基因中与细胞粘附能力有关的基因大抑癌基因激酶2(LATS2),构建荧光素酶报告基因验证LATS2与miR-135a-5p的结合,利用原位杂交及染色质免疫共沉淀(ChIP)法验证miR-135a-5p对LATS2下游通路中YAP1/TEAD/MMP轴的调控作用。3.5构建人源肿瘤异种移植模型(PDX模型),采用实时荧光定量qRT-PCR检测PDX小鼠模型来源的肿瘤细胞外泌体对裸鼠肝组织中miR-135a-5p、CD30、TNFα、LATS2、Yes相关蛋白1(YAP1)及基质金属蛋白酶7(MMP7)基因的mRNA表达水平的影响。制备PDX单细胞进行细胞培养,分别转染miR-135a-5p mimics和miR-135a-5p knockdown质粒,利用Transwell实验检测miR-135a-5p对PDX模型中细胞迁移与侵袭能力的影响。构建结直肠癌细胞裸鼠肝转移模型,免疫荧光法检测PDX裸鼠模型来源外泌体miR-135a-5p对结直肠癌肝转移微环境的影响。4.血清miR-135a-5p应用于结直肠癌辅助诊断及预后评估的初步探索提取结直肠癌血清中总RNA,利用qRT-PCR方法检测同一结直肠癌患者发生肝转移前(2010年)以及发生肝转移后(2015年)血清中miR-135a-5p的表达水平,探索miR-135a-5p与结直肠癌患者发生肝转移的相关性。在本研究中,招募术前经过化疗的早期(I/II期)CRC患者样本探索miR-135a-5p对早期结直肠癌患者肝转移及预后的影响。将I/II期结直肠癌患者血清样本分为miR-135a-5p高表达组和miR-135a-5p低表达组,分析放化疗治疗对早期结直肠癌患者生存时间的影响。利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)计算曲线下面积(area under the curve,AUC)来判断血清miR-135a-5p在CRC辅助诊断中的价值。主要研究成果1.结直肠癌组织miRNA差异表达谱的分析1.1结直肠癌患者组织中miRNA的差异表达分析miR-135a-5p在癌旁-腺瘤-癌组织中表达水平呈逐渐增加趋势,进一步在大样本中验证了miR-135a-5p的表达,差异均有统计学意义。miR-135a-5p单独诊断结直肠癌的AUC值在Testing样本、Valadation样本和combination样本中分别为0.73、0.77和0.74,表明肿瘤组织样本中miR-135a-5p的表达水平对结直肠癌的辅助诊断具有较高的效力。1.2 miR-135a-5p表达水平与结直肠癌发病风险研究TMA样本中miR-135a-5p的表达水平检测结果显示:Testing样本、Validation样本及Combination样本中结直肠癌组织中miR-135a-5p的表达水平显著高于癌旁组织。miR-135a-5p的表达与患者是否出现淋巴结转移、远端转移和肿瘤TNM分期有关(P<0.05);患者年龄大于55岁、肿瘤恶性程度高、TNM为III/IV期以及高表达水平的miR-135a-5p是影响结直肠癌生存时间的危险因素(P<0.05);miR-135a-5p高表达的结直肠癌患者的生存时间显著减少(P<0.0001);miR-135a-5p的表达水平在肝转移的患者肿瘤组织与癌旁组织中的差异有统计学意义(P<0.001),在除肝脏之外的其他器官转移的结直肠癌患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-135a-5p的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),提示miR-135a-5p与结直肠癌肝转移密切相关。2.miR-135a-5p对结直肠癌转移的影响2.1 miR-135a-5p在结直肠癌细胞中的功能研究缺氧微环境可以促进结直肠癌细胞中miR-135a-5p的表达。侵袭与迁移能力检测结果显示:miR-135a-5p过表达可以增加SW620、HCT116细胞的迁移和侵袭能力;缺氧对miR-135a-5p敲除后的SW620细胞的迁移和侵袭能力无显著影响。2.2 miR-135a-5p在体内实验中与结直肠癌肝转移的研究在裸鼠荷瘤模型中,miR-135a-5p敲除显著抑制了肿瘤的生长,miR-135a-5p过表达促进了肿瘤的生长。利用酶标仪检测裸鼠荷瘤模型中裸鼠的肿瘤组织、肝脏及肺组织的组织匀浆的荧光强度,发现miR-135a-5p敲除显著降低肿瘤组织及肝组织的荧光强度,miR-135a-5p过表达显著增加肿瘤组织及肝组织的荧光强度,不同处理组小鼠肺组织中的荧光强度无明显差异,提示miR-135a-5p可以促进结直肠癌的生长及肝转移的发生。3.外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响及机制研究3.1外泌体中miR-135a-5p在结直肠癌中的表达分析本研究在结直肠癌患者和健康对照人群血清中以及结直肠癌细胞SW620培养上清分离提取出白色沉淀,通过透射电镜观察发现白色沉淀物呈椭圆形或圆形,囊泡直径在30-50 nm,符合外泌体的形态学特征。结直肠癌患者来源的外泌体的数量明显多于健康对照人群,结直肠癌患者血清来源的外泌体中miR-135a-5p的表达水平高于健康对照组,并且肝转移的结直肠癌患者血清外泌体中miR-135a-5p的表达水平明显高于原发性的结直肠癌患者,缺氧促进SW620细胞中外泌体的分泌及外泌体中miR-135a-5p的表达。为了进一步研究外泌体是否进入肝脏组织中及在此过程中缺氧发挥的生物学作用,本研究构建了Pre-niche小鼠肝转移模型。发现结直肠癌来源的外泌体可进入肝脏组织,PKH26与F4-80的表达存在明显共定位现象。3.2外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响通过将结直肠癌肝转移病人血清来源外泌体经尾静脉注射入C57BL/6J小鼠体内,改变结直肠癌细胞外泌体微环境构建外泌体诱导小鼠肝转移模型(Pre-niche模型),发现来源于结直肠癌肝转移病人血清外泌体处理的小鼠,注射SW620细胞后,肝脏组织出现明显的病理性改变,肝组织中出现明显的核分裂象的细胞即为肿瘤细胞,并且结直肠癌肝转移病人血清外泌体处理组的小鼠肝组织中miR-135a-5p的表达水平明显高于健康对照组。在小鼠的肺组织中未观察到明显的病理性改变。并且发现野生型SW620细胞上清外泌体诱导小鼠发生肝转移,而缺氧会促进肝转移的发生,同时肿瘤组织中miR-15a-5p的表达水平增加。相反,miR-135a-5p敲除的SW620细胞组小鼠肝组织未发现miR-135a-5p的表达,并且未发现明显的转移灶。3.3外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌免疫抑制的影响及机制研究筛选出miR-135a-5p作用在肝组织细胞上的靶基因,其中有13个基因在野生型SW620外泌体共培养的肝组织细胞中表达显著上调,8个基因表达显著下调。通过生物信息学分析发现只有CD30基因的3’UTR序列可以潜在性与miR-135a-5p结合。荧光素酶报告基因验证CD30 3’UTR区域序列可以与miR-135a-5直接结合,外泌体穿梭miR-135a-5p能够抑制CD30 mRNA和蛋白的表达。在体内实验中,外泌体穿梭miR-135a-5p可以抑制小鼠肝组织中CD30蛋白的表达。结合已有的文献报道,CD30可以与TRAF2蛋白相互作用从而激活NF-κB信号通路,参与机体的免疫调节,并且CD30可促进肿瘤坏死因子-a(TNF-α)与白介素-2(IL-2)的表达,进而调节CD4~+T细胞的分化。本研究将野生型SW620上清来源的外泌体悬液经尾静脉注射入C57BL/6J小鼠体内,结果发现中外泌体处理组的小鼠肝组织中与CD30蛋白结合的TRAF2蛋白表达减少,NF-κB通路标签蛋白p65表达也相应减少,同样地,在HCT116细胞上清来源的外泌体处理组发现相似结果。外泌体中miR-135a-5p可以显著抑制小鼠血清中TNF-α的表达以及小鼠肝组织中IL-2的表达,从而抑制CD4~+的分化,发挥抗肿瘤免疫作用。3.4外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌细胞粘附能力的影响及其机制研究利用9个miRNA靶基因分析网站预测,LATS2和SP3同时被9个网站预测可能与miR-135a-5p结合。已有研究指出,LATS2是调控细胞粘附能力重要的基因,与肝癌的发生发展与转移密切相关。因此,选取LATS2作为miR-135a-5p的下游靶基因进行后续的机制研究。构建荧光素酶报告基因验证了LATS2 3’UTR区域序列可以直接与miR-135a-5p结合。已有文献报道,LATS2通过与致癌性活化因子YAP1作用使其失活,YAP1/TEAD1作为转录因子调控基质金属蛋白MMP家族的转录表达,从而增强癌细胞的粘附能力。因此,我们进一步验证miR-135a-5p抑制LATS2的表达是否影响YAP1/TEAD/MMP/复合体的激活,从而为结直肠癌细胞转移至肝脏提供有力的转移前微环境。在动物实验中发现外泌体穿梭miR-135a-5p可以抑制小鼠肝组织中LATS2的转录,显著降低小鼠肝组织中LATS2的表达,从而促进YAP1的表达。外泌体穿梭miR-135a-5p可以显著增加小鼠肝组织中MMP7的表达。利用染色质免疫共沉淀法验证了转录因子YAP1/TEAD1可以与MMP7的启动子区结合,调控MMP7的转录翻译。且经含有miR-135a-5p表达的外泌体诱导后,小鼠肝组织细胞中YAP1/MMP7的结合增强,提示转录因子YAP1/TEAD1复合体可以调控MMP7的转录,外泌体穿梭miR-135a-5p可以增强YAP1/TEAD1与MMP7的结合作用,从而增加结直肠癌细胞在肝组织中的粘附能力。3.5 miR-135a-5p通过外泌体诱导促进PDX小鼠模型发生肝转移我们成功构建结直肠癌来源的PDX小鼠模型,发现与原位肿瘤来源的外泌体处理组相比,肝转移来源的外泌体处理组经SW620细胞注射后,小鼠肝组织中的miR-135a-5p、YAP1、MMP7的mRNA表达水平明显增加,肺转移来源的外泌体处理组小鼠肝组织中miR-135a-5p、CD30、TNFα、LATS2、YAP1及MMP7的mRNA表达水平无明显差异,表明外泌体miR-135a-5p可以调控结直肠癌肝转移发生过程中的免疫抑制通路及细胞粘附能力。miR-135a-5p在肝转移的PDX肿瘤组织中及PDX细胞上清外泌体中高表达,提示其与结直肠癌肝转移的发生密切相关,与前期结果相一致。细胞侵袭与迁移能力检测发现外泌体穿梭miR-135a-5p可以增强PDX模型中细胞迁移与侵袭能力,肝转移来源的PDX细胞恶性程度更高,具有较强的细胞侵袭与迁移能力。4.血清miR-135a-5p对结直肠癌肝转移筛查的初步探索在Testing样本、Validation样本以及Combination样本中,结直肠癌患者血清中的miR-135a-5p的表达水平显著高于健康对照人群,血清中miR-135a-5p单独诊断结直肠癌的AUC值在Testing样本、Valadation样本和combination样本中分别为0.83、0.71、0.74。结直肠癌患者发生肝转移后血清中miR-135a-5p的水平明显高于发生肝转移前。对于血清中miR-135a-5p高表达的I/II期早期结直肠癌患者,接受放化疗可明显增加患者的生存时间。提示血清中miR-135a-5p对结直肠癌的辅助诊断和预后评估具有一定的指导意义。研究结论1.miR-135a-5p在癌旁组织-腺瘤组织-结直肠癌组织中表达逐渐增加,与结直肠癌患者肝转移的发生和生存时间有关联。2.miR-135a-5p可以增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,促进结直肠癌肝转移的发生。3.外泌体穿梭miR-135-5p经Kupffer细胞吞噬进入肝脏,诱导肝转移前Pre-niche机制的形成,通过以下通路促进结直肠癌肝转移的发生:1)抑制肝组织中TNF-α和血清中IL-2的表达,从而抑制CD4~+T细胞的分化,发挥抗肿瘤免疫作用;2)调节LATS2/YAP1/TEAD1/MMP7轴,增加结直肠癌细胞在肝组织中的粘附能力。4.血清中miR-135a-5p对结直肠癌患者辅助诊断和预后评估具有一定的指导意义。