皮肤癌是人类较为常见的恶性肿瘤。近年来,其在世界各国的发病率和死亡率都呈快速上升趋势,尤其在美国,皮肤癌的发病率超过所有其他人类恶性肿瘤的总和。长期暴露于日光中的紫外线(solar ultraviolet,SUV)辐射是导致皮肤癌发生发展的主要危险因素。根据波长的长短,日光中的紫外线可以分为三类,其中UVA(320-400nm)与UVB(280-320nm)均能穿透皮肤,对皮肤产生致癌作用。而UVC(200-280nm)虽然能量较高,但由于其大部分被臭氧层所吸收,对皮肤影响较小。据统计,大约90%以上的非黑素瘤性皮肤癌(NMSCs)起源于日光中紫外线的照射。丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路的激活在调控SUV诱导的细胞应答中起着至关重要的作用。由于SUV的刺激,细胞外的信息经由MAPKs信号通路被传递至细胞核内,从而介导细胞的增殖、分化、应激以及凋亡等一系列生物学效应。T型淋巴因子激活的杀伤细胞源蛋白激酶(T-lymphokine-activated killer cell-originated protein kinase,TOPK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)家族的新成员,并在多种肿瘤细胞中过度表达。TOPK作为MAPKs的上游激活物,与炎症的发生、DNA损伤、细胞的凋亡及肿瘤的形成等密切相关,并已被确认为致癌基因参与多种细胞内信号传导。近年来,虽然有数据显示抑制TOPK的活性有益于癌症的化学预防与治疗,但TOPK抑制剂却十分罕见。此外,目前尚未有报道阐述TOPK抑制剂在日光紫外线致皮肤癌中的作用机制。在本研究中,基于寻找预防及治疗靶向TOPK抑制日光中紫外线诱导的皮肤癌的新型小分子化合物的目的,我们研制出了一个潜在的TOPK抑制剂,5-((1s,3s)-adamantan-1-yl)-3-(hydroxyimino)indolin-2-one(ADA-07)。我们通过计算机对接模型、体外ADA-07与TOPK结构域中ATP的竞争抑制关系以及体外蛋白激酶活性的检测确定了此小分子化合物的作用靶标。同时,我们进一步在细胞水平上验证了ADA-07对TOPK下游信号传导通路的影响。更重要的是,我们发现在SUV诱导SKH-1小鼠皮肤癌的模型中,ADA-07不仅能够有效预防皮肤癌的发生,而且在SUV诱导的皮肤癌中具有潜在的治疗效果。第一章ADA-07抑制非黑素瘤性皮肤癌细胞的增殖方法1.合成潜在的TOPK抑制剂,并检测该化合物对正常皮肤细胞的毒性。2.软琼脂克隆形成实验检测化合物ADA-07对细胞生长因子EGF诱导的小鼠正常上皮细胞的锚定非依赖生长的影响。3.细胞增殖实验检测化合物ADA-07对人类非黑素瘤性皮肤癌细胞株增殖的影响。结果1.ADA-07对正常皮肤细胞无明显毒性潜在的TOPK抑制剂ADA-07由Dr.Kanamata Reddy合成。MTS实验结果表明,经不同浓度的ADA-07分别处理正常小鼠上皮细胞JB6 P+与正常人类皮肤纤维母细胞NHDF后,两株细胞对照组的增殖效率与ADA-07处理组的增殖效率并无显著性差异。提示:ADA-07对小鼠及人类正常皮肤细胞均无显著的细胞毒性。2.ADA-07抑制EGF诱导的小鼠正常上皮细胞的锚定非依赖生长软琼脂克隆形成实验结果显示,未经EGF处理的小鼠上皮细胞株JB6 P+并无明显克隆形成,而用EGF处理后,JB6 P+细胞发生转化,即可见大量克隆的形成。当对EGF作用后的JB6 P+细胞株处理不同浓度的ADA-07时,发现此化合物呈剂量依赖性抑制该细胞株的锚定非依赖生长,并在浓度为10μM时显著抑制了该细胞的克隆形成。3.ADA-07抑制人类非黑素瘤性皮肤癌细胞的增殖结晶紫染色实验结果表明,化合物ADA-07剂量依赖性抑制非黑素瘤性皮肤癌细胞株SCC12、SCC13和A431的生长。第二章ADA-07体外结合并抑制TOPK蛋白激酶的活性方法1.超级计算机分子模拟化合物ADA-07与TOPK蛋白的相互结合区域。2.化合物ADA-07与TOPK蛋白激酶的ATP竞争抑制实验。3.化合物ADA-07的蛋白拉下实验。4.同位素标记的体外激酶活性实验。结果1 ADA-07与TOPK蛋白激酶的ATP结合区域结合超级计算机分子模拟实验显示,小分子化合物ADA-07与TOPK的ATP结合口袋存在相互作用,并与这一结构结合形成复合物。2 ADA-07竞争抑制ATP与TOPK蛋白激酶的结合ATP竞争实验结果证明,小分子化合物ADA-07能够作用于TOPK的ATP结合口袋,并呈剂量依赖性竞争抑制ATP与TOPK的结合。3 ADA-07体外结合TOPK或MEK1/2蛋白激酶蛋白拉下实验证明,小分子化合物ADA-07能够分别与TOPK和MEK1/2蛋白相结合,形成复合物。4 ADA-07体外抑制TOPK激酶活性同位素标记的体外激酶实验结果显示,ADA-07对TOPK激酶活性具有明显抑制作用,但对MEK激酶活性并无明显抑制作用。这一结果说明,ADA-07仅对TOPK的激酶活性有显著抑制作用。第三章ADA-07抑制日光紫外线诱导的TOPK信号传导通路的活化方法1.Western blot检测Ha Ca T细胞株和JB6 P+细胞株处理ADA-07后对于日光紫外线诱导的TOPK蛋白激酶及其下游通路的影响。2.Western blot检测非黑素瘤性皮肤癌细胞株处理ADA-07后对于TOPK激酶及其下游通路的影响。3.Western blot检测Ha Ca T细胞株和JB6 P+细胞株处理ADA-07后对于日光紫外线诱导的c-Jun磷酸化水平的影响。同时,Western blot检测SCC12细胞株和A431细胞株处理ADA-07后c-Jun磷酸化水平的改变。4.荧光素酶报告基因实验检测JB6 P+细胞株处理ADA-07对紫外线诱导的AP-1荧光素酶活性的影响。同时,荧光素酶报告基因实验检测A431细胞株处理ADA-07以及敲除TOPK基因的A431细胞株处理ADA-07对AP-1荧光素酶活性的影响。结果1.ADA-07抑制日光紫外线诱导的TOPK信号传导通路的活化Western blot结果显示,当TOPK通路被日光紫外线有效激活后,ADA-07能够显著抑制TOPK下游激酶ERK1/2、p38和JNKs的磷酸化水平。这提示:在Ha Ca T和JB6 P+细胞株中,ADA-07对日光紫外线激活后的TOPK激酶不直接产生作用,但却能够抑制TOPK下游信号传导通路的活化。2.ADA-07抑制TOPK信号传导通路的活化Western blot结果表明,在人类非黑素瘤性皮肤癌细胞株中,ADA-07能够显著抑制TOPK下游激酶ERK1/2、p38和JNKs的磷酸化水平。这提示:在SCC12和A431细胞株中,ADA-07不直接对TOPK激酶产生作用,但却能够有效抑制TOPK下游信号传导通路的活化。3.ADA-07抑制c-Jun的磷酸化水平Western blot结果表明,在Ha Ca T和JB6 P+细胞株中,ADA-07能够显著抑制日光紫外线诱导的c-Jun的磷酸化水平。在人类非黑素瘤性皮肤癌细胞株中,ADA-07同样能够有效抑制c-Jun的磷酸化水平。这提示:ADA-07对cJun的磷酸化水平具有抑制作用。4.ADA-07抑制Activator protein-1(AP-1)荧光素酶活性荧光素酶报告基因结果显示,对已转染AP-1荧光素酶报告基因质粒的JB6P+细胞株进行ADA-07和日光紫外线处理后,AP-1荧光素酶活性随着ADA-07浓度的升高而逐渐降低。同时,在A431细胞株中敲除TOPK基因,显示AP-1荧光素酶活性受到了抑制,且ADA-07在A431细胞株中能够抑制AP-1荧光素酶的活性,但在TOPK基因敲除的细胞中,仅在最高浓度对AP-1的活性产生影响。结果提示:ADA-07通过靶向TOPK抑制AP-1荧光素酶的活性。第四章ADA-07抑制日光紫外线致SKH-1无毛小鼠皮肤癌的形成方法1.建立日光紫外线照射致SKH-1无毛小鼠皮肤癌早期预防模型,并检测ADA-07在该模型中对小鼠皮肤癌形成的影响。2.苏木精-伊红染色(H&E染色)及免疫组织化学检测该模型对照组与ADA-07处理组小鼠皮肤病理学改变及增值标志PCNA水平。3.Western blot检测ADA-07对该模型小鼠皮肤组织TOPK信号传导通路的影响。结果1.ADA-07完全抑制日光紫外线诱导的SKH-1无毛小鼠皮肤癌的形成该皮肤癌早期预防模型显示,对照组小鼠背部皮肤可见大量丘疹和菜花样瘤体形成,而ADA-07处理组无论是低剂量组还是高剂量组,小鼠背部皮肤都未见任何丘疹或疑似肿瘤的形成。结果提示:在日光紫外线致SKH-1无毛小鼠皮肤癌早期预防模型中,ADA-07能够完全抑制小鼠皮肤癌的形成。2.ADA-07显著抑制日光紫外线辐射引起的小鼠皮肤病理学改变H&E染色及免疫组织化学检测结果表明,对照组小鼠背部皮肤全层增厚,角质形成细胞核较大且深染,胞浆红染并出现角化不全细胞,伴随大量鳞癌角化珠。部分肿瘤向真皮层侵袭,并同时伴有乳头瘤、纤维瘤等组织病理改变。PCNA表达量较高。而ADA-07处理组小鼠背部皮肤组织结构完整、层次分明,仅表现为表皮棘层轻度增厚,未见其他病理学改变。PCNA表达明显被抑制。这些结果提示:对照组小鼠皮肤具有光化性角化病(AK,早期原位鳞癌)及部分皮肤鳞状细胞癌(SCC)病理特征。而ADA-07能够显著抑制日光紫外线辐射引起的小鼠皮肤病理学改变。3.ADA-07抑制日光紫外线辐射后小鼠皮肤组织TOPK信号传导通路的活化Western blot结果证实,ADA-07能够显著抑制TOPK下游激酶ERK1/2、p38和JNKs的磷酸化水平。这提示:在日光紫外线辐射后的小鼠皮肤组织中,ADA-07能够有效抑制TOPK信号传导通路的活化。第五章ADA-07抑制日光紫外线致SKH-1无毛小鼠皮肤癌的生长方法1.建立日光紫外线照射致SKH-1无毛小鼠皮肤癌晚期预防模型,并检测ADA-07在该模型中对小鼠皮肤癌生长的影响。2.苏木精-伊红染色(H&E染色)及免疫组织化学检测该模型对照组与ADA-07处理组小鼠皮肤病理学改变及增值标志PCNA水平。3.Western blot检测ADA-07对该模型小鼠皮肤组织TOPK信号传导通路的影响。结果1.ADA-07抑制日光紫外线诱导的SKH-1无毛小鼠皮肤癌的生长该皮肤癌晚期预防模型显示,对照组小鼠背部皮肤可见大量丘疹和菜花样瘤体形成。ADA-07低剂量处理组小鼠背部皮肤见少量丘疹或疑似肿瘤的形成,而ADA-07高剂量组仅见少量丘疹形成。ADA-07处理组小鼠背部丘疹或疑似肿瘤体积和数量明显低于对照组小鼠。结果提示:在日光紫外线致SKH-1无毛小鼠皮肤癌晚期预防模型中,ADA-07能够抑制小鼠皮肤癌的生长。2.ADA-07抑制日光紫外线辐射引起的小鼠皮肤病理学改变H&E染色及免疫组织化学检测结果表明,对照组小鼠背部皮肤全层增厚,角质形成细胞核较大且深染,胞浆红染并出现角化不全细胞,伴随大量鳞癌角化珠。部分肿瘤向真皮层侵袭,并同时伴有乳头瘤、纤维瘤等组织病理改变。PCNA表达量较高。而ADA-07处理组小鼠背部皮肤组织结构相对完整、层次较分明,部分细胞出现不典型性增生,极少部分肿瘤具有AK病理特征,未见肿瘤真皮层侵袭及鳞癌角化珠等病理改变。PCNA表达明显被抑制。这些结果提示:ADA-07能够抑制日光紫外线辐射引起的小鼠皮肤病理学改变。3.ADA-07抑制日光紫外线辐射后小鼠皮肤组织TOPK信号传导通路的活化Western blot结果证实,ADA-07能够显著抑制TOPK下游激酶ERK1/2、p38和JNKs的磷酸化水平。这提示:在日光紫外线照射后的小鼠皮肤组织中,ADA-07能够有效抑制TOPK信号传导通路的活化。结论1.新型特异性TOPK抑制剂ADA-07对小鼠及人类正常皮肤细胞没有显著的毒性,但能够有效抑制EGF诱导的小鼠正常细胞的锚定非依赖生长以及人类非黑素瘤性皮肤癌细胞的增殖。2.计算机分子模拟、体外水平、细胞水平以及体内水平的研究结果证实:ADA-07直接作用于TOPK的ATP结合区域上,通过ATP竞争的方式特异性抑制TOPK激酶活性,继而抑制其下游信号传导通路的活化,最终抑制日光紫外线诱导的皮肤癌的生长和增殖。3.日光紫外线辐射致SKH-1无毛小鼠皮肤癌早期预防与晚期预防模型的建立。动物模型结果与细胞水平实验结果相一致,证实ADA-07能够有效抑制日光紫外线诱导的皮肤癌的形成和生长,且无明显毒副作用。提示TOPK可以作为新的药物靶点运用于日光紫外线诱导的皮肤癌,且新型TOPK抑制剂ADA-07为日光紫外线致非黑素瘤性皮肤癌的预防提供了新的选择,并具有一定的靶向治疗潜力。